原创 医学参考报 干就有未来 

撰文│巢怡茗

编辑│陈圆圆

审校│汤红明

类器官（organoid）也被称为微器官（mini-organ），是近10年来干细胞领域发展最快的研究热点之一。类器官是指应用多能干细胞或者成体干细胞进行体外三维培养，干细胞通过自发形成组织进而得到的一类与体内器官结构高度相似、并能重现对应器官部分功能的细胞培养物。与传统的动物模型和二维细胞培养相比，类器官在研究人体发育和疾病领域具有众多优势：类器官可通过人源的多能干细胞或成体干细胞培养获得，从而克服了动物模型与人类器官在结构、细胞类型、分子水平以及遗传背景等多个方面不同的不足；与二维细胞培养相比，类器官具有类似于体内器官的空间结构和细胞组成，并具有多种相应器官功能的特征。基于其众多优点，类器官培养体系一经创立便得到了广泛关注和极大发展。本文重点针对脑类器官，分别介绍其培养方法、基础研究和转化应用前景。

一、

脑类器官的培养

目前，脑类器官的培养方法基于是否进行定向分化可以分为两种：一种是干细胞在分化过程中形成的类器官结构，不依赖外源性的形态发生因子而得到的包含多脑区类器官的培养方法；而另一种则是根据人脑发育过程的调控机制，在特定时间加入外源性形态发生因子和神经营养因子，从而培养出特定脑区的类器官。

2013年，Lancaster和Knoblich首次建立了包含多个脑区的脑类器官的培养方法。首先将人胚胎干细胞/可诱导多能干细胞培养成胚状体，通过将其在神经诱导培养基中培养，分化、扩增成神经外胚层，然后将其包埋入基质胶中，通过在神经分化培养基中振摇培养，扩增神经上皮芽。随着类器官的增长，神经上皮细胞萌芽中开始产生类似于侧脑室中的脑脊液，而神经上皮细胞也开始进一步分化、向外层迁移，最终形成了包含有类似于前脑、脉络丛、海马区、前额叶等多个脑区结构的脑类器官培养物。

而脑类器官定向分化的培养方法是由类器官领域的先驱者之一、已故日本科学家Yoshiki Sasai研究团队创立的。基于团队前期研制的无血清培养基，Sasai课题组通过在不同时间点加入不同的形态发生因子，分别将人源或鼠源的胚胎干细胞分化得到了大脑皮层、小脑、海马等不同脑区的类器官模型。

尽管以上非定向分化脑类器官包含多个脑区，但这些脑区的分布是比较随机的，而通过将定向分化为不同脑区的类器官进行融合培养，可以构建更为复杂的脑发育和疾病模型，以研究多脑区协同运作的生物学问题。此外，还有将小胶质细胞与脑类器官共同培养，以此向脑类器官中引入中枢神经系统的免疫细胞。又如将表达促使血管内皮细胞转录因子的胚胎干细胞与野生型胚胎干细胞混合培养脑类器官，从而在培养过程中形成类似于血管结构的脑类器官模型。相信随着脑类器官培养方法的不断更新，研究人员将培养出结构和功能更接近人脑的类器官模型。

二、

脑类器官疾病模型的建立及疾病机制探索

近年来，随着脑类器官培养条件的不断完善，研究人员已依赖于这些技术建立起多种神经系统疾病模型。比如脑发育异常、小头畸形、寨卡病毒感染、脑肿瘤、阿尔茨海默病等。

由于脑类器官由各类干细胞生长而来，因此一定程度上可以模拟早期脑发育的特征。Livesey团队通过培养不同灵长类动物的脑类器官，研究神经前体细胞在皮层发育过程中不同行为导致脑容积不同的机制。Kriegstein 研究团队通过比较猴子、猩猩和人的脑类器官，发现人神经前体细胞表达较高水平的PI3K-AKT-mTOR信号通路，验证了人脑发育特异性的分子特征。Camp和Treutlein团队通过单细胞测序人和猩猩的脑类器官，构建了人特异性的脑发育细胞类型特征。

在疾病模型建立方面，Lancaster应用携带CDK5RAP2基因突变的小头畸形患者iPSC构建的小头畸形类器官模型，从细胞水平揭示了CDK5RAP2基因突变致畸的机制。麻省理工大学的Jaenisch研究团队应用脑类器官技术探索染色体着丝点突变诱发小头畸形的分子机制。另外，也有研究团队分别应用脑类器官研究小头畸形致病基因ASPM和WDR62导致小头畸形的分子机制。

除了应用小头畸形病人来源的iPSC建立的小头畸形脑类器官模型以外，多个研究团队应用脑类器官探索寨卡病毒致小头畸形的分子机制。他们发现寨卡病毒可以特异性的感染神经前体细胞，并可激活TLR3，诱发前体细胞的凋亡，进而导致胎儿的脑部发育异常。

此外，也有研究组针对唐氏综合征进行研究。唐氏综合征也被称为21-三体综合征，是由于21号染色体异常而导致的智力发育迟缓的发育疾病。Jiang团队通过培养唐氏综合征患者的脑类器官，发现21号染色体上OLIG的过表达会导致中间神经元的过度产生，表明唐氏综合征导致的神经发育异常有可能是过量的中间神经元导致的。

脑肿瘤由于其细胞和遗传高度异质性，临床治疗手段非常有限。而目前的研究模型包括肿瘤细胞系、转基因动物模型、脑肿瘤异种移植模型均有相应的局限，脑类器官的出现为脑肿瘤研究提供了新的技术支持。Knoblich实验室在脑类器官培养过程中将脑肿瘤基因组测序发现临床相关的突变和原癌基因引入，建立了人脑类器官胶质膜细胞瘤模型和中枢神经系统原始神经外胚层肿瘤模型。此模型不仅在组织形态学、转录组、肿瘤侵染性等多个方面与患者肿瘤样本类似，而且可作为靶向药物测试的新平台。Verma研究团队将p53突变和Ras原癌基因导入类器官中，获得了胶质母细胞瘤的类器官模型。此外，Fine团队将病人来源的胶质膜细胞瘤细胞移植入脑类器官中，建立了另一种脑肿瘤类器官模型。

长期以来人们认为脑类器官只能模拟早期脑发育，因而并不适合模拟神经退行性疾病。然而，也有研究人员应用阿尔茨海默病人来源的iPSC培养脑类器官，发现这些脑类器官中有一些阿尔茨海默病相关的病征，如Aβ的聚集、高度磷酸化的Tau蛋白，他们还发现加入β和γ分泌酶抑制剂后可以显著缓解患者来源类器官中的病征。此外，研究人员也提出设想，比如在iPSC衍生的神经元中诱导与年龄相关的特征，包括应用ROS或线粒体相关的应激源，或通过表达progerin诱导更广泛的衰老等。另外也有方法，如将成年体细胞直接重编程（转分化）为具有特定转录因子混合物的细胞，因为直接体细胞重编程不会消除年龄相关的细胞特征。这些方法都能在一定程度上弥补用脑类器官模拟神经退行性疾病的缺陷。

三、

脑类器官的转化应用前景

除了利用脑类器官建立一系列疾病研究模型以深入探究其病因及致病机制，研究人员还利用这些脑类器官模型在治疗方面发挥作用，例如药物筛选、移植等。

由于脑类器官可通过不断培养来增加样本数量，因而为体外大规模测试药物功效、制定出有效治疗策略提供了技术平台。其次，产生患者特异性类器官的可能性意味着可以创建个性化的疾病模型，有助于理解多基因疾病的发病机制。

此外，细胞替代疗法也是目前研究人员所关注的热点之一。细胞替代疗法治疗神经系统疾病大都是将干细胞定向分化为某种特定的神经元或前体细胞，将其移植到患者的病灶部位，以取代损伤的神经元来修复病灶部分的神经损伤。然而，目前这种方法移植的细胞存活率较低。脑类器官可以在体外模拟类似体内的微环境，具有类似体内的结构和细胞类型的多样性，因此有研究者认为将脑类器官进行移植用于细胞治疗可能会有更好的效果。Gage研究团队将脑类器官整体移植入小鼠的头部，发现类器官可以整合入小鼠的大脑，不仅可以在类器官部分发现小鼠来源的血管提供养分，而且发现类器官中的神经元可以整合入小鼠的神经网络中。这项研究为类器官细胞替代治疗奠定了试验基础。

近些年来，干细胞培养脑类器官技术已经取得了巨大突破。尽管这些大脑类器官尚存在诸多不足，但这项技术能够在很大程度上概括出人类大脑的许多关键特征，可拓展研究人类大脑发育和疾病的能力。在临床应用方面，相信临床医生们也可以利用好人脑类器官这一工具，为神经系统疾病患者带来个性化的方式筛选药物和其他治疗干预措施，迎接精准医学时代的到来。

（本文来源于《医学参考报》干细胞与再生医学专刊2020-05期第2版文章，ID：yxckbsc2020050201），图片来源于网络，如有侵权，请联系删除。）

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