红细胞裂解液（货号：OCM-50）

4、使用PDO进行药筛的最佳代数？

答：一般建议使用P3-P5代的PDO进行药筛。

5、类器官回收方法？如何优化？

答：根据实验目的选择使用类器官回收试剂或者机械吹打方式进行去胶回收。为了收集到更多的类器官，在扩增阶段可以留少量的基质胶进行后续传代，冻存则需尽量去除基质胶成分。

类器官回收液（货号：ORS-100）

6、如何对类器官或细胞团进行计数？是否需要对肠隐窝数量进行计数后才使用基质胶包裹肠隐窝后种板？

答：根据实验室的显微镜平台选择台盼蓝染色后的血小板计数观察，或者其他活细胞监测、追踪系统等。一般对于类器官数量有要求的实验，建议对类器官或细胞团进行计数。

以肠隐窝接种为例，用基质胶重悬组织沉淀时，推荐重悬密度为每10μL基质胶悬液含200至600个隐窝。为了保证原代培养的成功率或重复样本间一致性，可以在重悬前取适量悬液进行镜检和隐窝计数，计数完成后吸取含所需隐窝量的悬液进行离心，然后加合适体积的基质胶进行重悬。

7、基质胶与类器官混匀的时候往往会产生气泡，如何在操作中减少气泡的产生？

答：基质胶与类器官混匀步骤需要在冰上进行，并尽快完成。为了避免气泡产生，可以在吹打混匀时在枪头留1mm左右的液体柱，如果不小心产生气泡可以先吸走后再进行种板。

铝制冰盒

8、使用润洗液的主要目的是什么？可以反复使用吗？

答：在类器官吹打混匀或者转移过程中，建议使用经润洗液预处理的枪头，主要为了降低枪头内壁对类器官的吸附作用，减少类器官的损失。在不污染类器官样本的前提下，润洗液可以反复使用。

类器官润洗液（货号：OMR-100）

9、冻存液的主要成分是什么？普通细胞的冻存液可以使用吗？

答：类器官冻存液一般建议使用含＞50% FBS的DMSO或培养基成分。部分干细胞用的冻存液，可以尝试用于类器官冻存。

类器官冻存液（货号：OFM-50）

10、类器官鉴定常用的指标有哪些？

答：在组织形态学方面，常使用HE染色、免疫组化或荧光染色观察原组织及其衍生的类器官组织的病理结构、特异性标记物的表达分布等进行一致性鉴定。在基因组学方面，采用全外显子组测序、NGS测序、转录组测序、SNP检测等手段鉴定一致性。在功能表型方面，通过神经信号传导、心脉搏动、视网膜感光等组织特异性表型，初步判定类器官具有与原组织一致的功能特征。

以小鼠小肠类器官鉴定为例，可以使用肠绒毛标记物Villin，杯状细胞标记物Muc2，肠上皮细胞标记物E-cadherin，潘氏细胞标记物Lyz等的免疫荧光染色观察，确定其中的肠细胞组成。

小鼠小肠类器官免疫荧光鉴定图

11、离心转速是多少？时间是多少？

答：不同离心机的转速和离心力不一样，一般选用300g或1500rpm离心3分钟。

12、回收清洗时重复2-3次离心的目的是什么？

答：尽量去除非上皮组织。

13、基质胶包被，基质胶加太多了会不会影响类器官生长？

答：24孔板每孔建议加30μL基质胶。

14、为什么我加100μL一个孔（24孔），隐窝长3天就碎了？

答: 可能与基质胶或者培养基成分不合适有关。

小鼠小肠类器官完全培养基（货号：MICM-100）

15、直接加纯胶吗？

答：基质胶体积比建议70%以上。

16、原代铺板密度多少比较合适？

答：推荐重悬密度为每10μL基质胶悬液含200至600个隐窝。

17、基质胶凝固过程需要倒立放置吗？

答：倒置更利于形成圆顶结构。

18、基质胶贴壁了会有什么后果？

答：贴壁可能会影响类器官成团生长，干细胞干性的维持受到影响。

19、基质胶加在中央，如果不倒立，凝固了隐窝也容易沉底怎么办？

答：可能是基质胶浓度不够，一定要70%以上的体积比，如果凝胶效果不是很好，建议用质量好一些的基质胶。

20、为什么我培养的原代成活率很低？

答：原代组织活性、培养基成分、基质胶等等都可能会影响到原代培养出类器官的数量。

21、后续沉淀清洗的意义是什么？均匀之后，大块的杂质不是也会被离心到沉淀里面吗？

答：根据组织区别选择对应孔径的细胞筛获取需要的细胞团快，并清洗去除消化液等试剂。

22、消化液的浓度是多少？

答：EDTA消化使用终浓度为5mmol/L。

实验操作回顾

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本文来源：类器官学社

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