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视频时长：5分40秒

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米氏方程

米氏方程（Michaelis-Menten equation）是表示一个酶促反应的起始速度与底物浓度关系的速度方程。 [1] 

底物浓度 [S] 对酶反映速度的影响

在酶促反应中，当底物浓度非常大时，反应速度接近于一个恒定值。在曲线的这个区域，酶几乎被底物饱和，反应相对于底物 S 是个零级反应。就是说再增加底物对反应速度没有什么影响。在低浓度底物情况下，反应相对于底物是一级反应；而当底物浓度处于中间范围时，反应（相对于底物）是混合级反应。

米氏方程是在假定存在一个稳态反应条件下推导出来的，其中 Km 值称为米氏常数， Vmax 是酶被底物饱和时的反应速度，[S] 为底物浓度。由此可见 Km 值的物理意义为反应速度 V 达到 ½Vmax 时的底物浓度（即 Km=[S]），单位一般为 mol/L。

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米氏常数

米氏常数 Km 是酶的特征常数之一，每一种酶都有它的 Km 值，Km 值只与酶的结构和所催化的底物有关，与酶浓度和底物浓度无关。因此，我们可以通过 Km 值来鉴别酶的种类，但是它会随着反应条件（温度、PH 值）的改变而改变。米氏常数被广泛应用到生物化学、分子生物学、基因工程、生物制药、临床用药等领域的理论、实验和实践中。

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米氏常数的意义

米氏常数在酶学和代谢研究中均为重要特征数据 ：

● 同一种酶如果有几种底物，就有几个 Km，其中 Km 值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物。不同的底物有不同的 Km 值，这说明同一种酶对不同底物的亲和力不同。一般用 1/Km 近似地表示酶对底物亲和力的大小，1/Km 愈大，表示酶对该底物的亲和力愈大，酶促反应易于进行。

● 已知某个酶的 Km，可计算出在某一底物浓度时，某反应速度相当于 Vmax 的百分率。

● 在测定酶活性时，如果要使得测得的初速度基本上接近 Vmax 值，而过量的底物又不至于抑制酶活性时，一般 [S] 值需为 Km 值的 10 倍以上。

● 催化可逆反应的酶，对正逆两向底物的 Km 往往是不同的。测定这些 Km 值的差别以及细胞内正逆两向底物的浓度，可以大致推测该酶催化正逆两向反应的效率，这对了解酶在细胞内的主要催化方向及生理功能有重要意义。

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米氏常数常见作图方法

酶促反应中的 Km 和 Vmax 值有几种测量方法。固定反应中的酶浓度，然后分析几种不同底物浓度下的起始速度，就可获得 Km 和 Vmax 值。但直接从起始速度对底物浓度的图中确定 Km 或 Vmax 值是很困难的，因为曲线接近 Vmax 时是个渐进过程。所以通常都是利用米氏方程的转换形式求出 Km 和 Vmax 值。

01

Lineweaver-Burk 双倒数作图法

将米氏方程转变为：

1/v=(Km/Vmax)(1/S)+1/Vmax

Lineweaver-Burk Plot

以 1/ v  对 1/[S] 作图，可以获得一条直线。从直线与 x 轴的截距可以得到 1/ Km 的绝对值；而 1/Vmax 是直线与 y 轴的截距。双倒数作图直观、容易理解，为酶抑制研究提供了易于识别的图形。

缺点：底物浓度低时，坐标点集中于坐标左下方，使得误差增大，往往偏离直线，Vmax、Km 无法精确定出。

解决方法：底物浓度配成 1/[S] 的浓度级差，而不是 [S] 的浓度极差，使点距离平均，再以最小二乘法线性回归分析。

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Eadie-Hofstee 作图法

将米氏方程转变为：

v=-Km(v/S)+Vmax

以 v 对 v/[S] 作图，得到的斜率是 -Km，x 轴截距是 Vmax/Km，y 轴截距是 Vmax。直接给出了 Vmax，但是 Km 最好由 Vmax/Km 计算出来，因为斜率的计算比较麻烦。

Eadie-Hofstee 作图法的一个好处是不像双倒数作图那样需要很长的外推才能算出 Km 值。但它有与双倒数法一样的缺陷，只是误差没有后者严重。此外，此作图法还有一个问题，就是横/纵坐标都含有变量 v，因此，v 有任何误差都会影响到两个轴。

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Hanes-Woolf 作图法

将米氏方程转变为：

S/v=(S/Vmax)+(Km/Vmax)

以 v 对 [S] 作图，得到的斜率是 1/Vmax，x 轴截距是 -Km，y 轴截距是 Km/Vmax。直接给出了 Km，但是 Vmax 最好由 Km/Vmax 计算而来，因为斜率的计算比较麻烦。

以上三种作图法都有一样的缺点，即数据点分散，但是双倒数和 Eadie-Hofstee 作图法更严重。此外，此作图法避免了 v 误差对 x 轴的影响，所以，相比上面两种 Hanes-Woolf 作图法是最佳的确定酶动力学常数的方法。

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如何使用 SoftMax Pro 软件中的米氏动力学模板

*视频时长：5’40”

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下面介绍一下如何使用米氏方程的模板。模板可以在Protocol Manager——Protocol Library——Binding and Enzymology 中的最后一个，单击打开。

打开一个模板首先需要查看 introduction 中对于模板的介绍。在这里，我们能看到米氏方程的公式，各个字符所代表的含义。以及米氏方程的变性公式，y=Ax/（x+B），这个方程是以底物浓度作为x变量，反应速率作为y变量，其中 A 表示最大反应速率，B 表示米氏常数 Km，并以矩形双曲线作图，得到底物浓度 x 和反应速率 y 之间关系的一元二次方程。

在进行酶活计算时，推荐底物浓度控制在 0.05-10Km 之间。文中有提到，一般进行米氏方程计算时会运用到 3 个线性拟合的变形公式，在这里也给出了 3 种方法作图的公式。这里我们就不再介绍了。

看完 introduction 介绍之后，可以到 plate 中进行读板参数的设置，如果参数与模板不同，可在 settings 里进行修改。

接下来我们在 template editor 中进行样品的定义，这里举个例子，B3-B10 是底物，底物的起始浓度是1nM，2 倍递增。 

设置好后，可以

读板结束后，可以查看读板参数，在 substrate1 里面查看到刚才设置的底物浓度 Concentration，根据读板结果，我们可以知道反应速度 v 是多少，同时还可以计算得到 1/S，1/v，v/S 和 S/v。

下面是 4 种不同的作图方法得到的曲线。第一个是反应速率 vs 底物浓度关系图，以底物浓度为 x 轴，反应速率为 y 轴，矩形双曲线拟合。

在这个图的下方我们可以看到该图的 R2，A 值和 B 值分别是多少，A 值表示最大反应速率 Vmax，B 值表示米氏常数 Km，这里还有 A 值和 B 值的 error bar，置信区间。

第二个是 Lineweaver-Burk 作图法，以 1/S 作为 x 轴，1/v 作为 y 轴，线性拟合，图下同样会有 R2，A 和 B 值分别是多少。 

第三个是 Eadie-Hofstee 图，以 v/S 作为 x 轴，v 作为 y 轴，线性拟合，图下同样会有 R2，A 和 B 值分别是多少。 

最后一个是 Woolf 图，以 S 作为 x 轴，S/v 作为 y 轴，线性拟合，同样自动计算得出 R2, A 和 B 值。 

最后可以在模板的 summary 中，更直观的看到本次实验的结果。包括米氏方程计算出的米氏常数 Km，反应速度 Vmax 和 R2。

在下面分别是 3 种常用作图法得到的米氏常数 Km，反应速度 Vmax 和 R2。

以上是对米氏方程模板的介绍。

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