摘要：

本文建立了金黄色葡萄球菌多位点序列分型的方法（MLST）。从英国牛津地区社区获得性和医院获得性侵袭性疾病患者的155株金黄色葡萄球菌分离株中获得了7个持家基因的内部片段序列。本文共鉴定出53个不同的等位基因图谱，其中17种由至少两种分离株代表。MLST方案具有很高的区分性，并通过脉冲场凝胶电泳显示具有相同等位基因分布的分离株对产生非常相似的SmaI限制性片段模式来验证。所有22个等位基因分布最普遍的等位基因均为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离株（MRSA），其等位基因谱与流行性MRSA克隆16（EMRSA-16）的参考菌株相同。还鉴定了四个MRSA分离株，其等位基因与英国医院流行的其他主要流行MRSA克隆（克隆EMRSA-15）相同。大多数分离株（81%）为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌分离株（MSSA），7个MSSA克隆包括5个或更多分离株。三个MSSA克隆包括至少五个来自社区获得性侵袭性疾病患者的分离株，可能代表毒性克隆，在其他健康个体中导致疾病的能力增加。最流行的MSSA克隆（17个分离株）与EMRSA-16密切相关，后者在医院引起疾病的成功可能是因为它是从一个致命的MSSA克隆中出现的，该克隆已经是社区和医院侵袭性疾病的主要原因。MLST提供了一种明确的方法，用于通过互联网将MRSA和MSSA分离株的方法分配给已知克隆，或者将它们的方法分配给新的克隆。

综述：

金黄色葡萄球菌是一种主要病原体，与严重的社区获得性和医院内疾病相关。在英国，金黄色葡萄球菌是仅次于大肠杆菌的血液培养物中第二常见的分离物，也是迄今为止最常见的医院获得的生物体。与严重疾病相关的临床综合征包括细菌血症、肺炎、心内膜炎、感染性关节炎、骨髓炎和深部脓肿形成。

在前抗生素时代，侵袭性金黄色葡萄球菌病的死亡率很高，青霉素的引入对治疗产生了巨大影响。半合成青霉素-甲氧西林于1959年被引入，以克服因青霉素酶产生的金黄色葡萄球菌对青霉素G和青霉素V产生耐药性而引起的问题。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株在20世纪60年代在欧洲和70年代在美国及其他地方迅速出现并成为医院内的主要临床问题。许多耐甲氧西林金黄色葡萄球菌菌株对大多数其他种类的抗菌剂都有耐药性，并且只对糖肽和新的研究药物敏感。最近关于MRSA对糖肽（糖肽-中间金黄色葡萄球菌）易感性降低的报道威胁着我们进一步损害了我们治疗医院获得性金黄色葡萄球菌感染的能力。

尽管MRSA和GISA引起的感染控制问题以及有限的治疗选择是医院主要关注的问题，医院内要求的大多数金黄色葡萄球菌感染和社区内要求的几乎所有金黄色葡萄杆菌感染都是由对甲氧西林和大多数其他类别抗生素敏感的菌株（甲氧西林敏感金黄色葡萄菌 [MSSA] ）引起的。很少有研究对MSSA分离株进行了表征，目前尚不清楚在社区（或医院）中流通的某些MSSA克隆是否具有导致严重感染（高毒克隆）的特殊能力，并具有国际分布。我们也不了解这一重要致病基因的种群和进化生物学的基本特征。

如果我们能够明确地描述金黄色葡萄球菌的分离株，就可以回答关于金黄色葡萄杆菌种群生物学的许多基本问题，以及更好地理解MRSA克隆的起源和传播，以及不同实验室描述的MRSA和MSSA克隆的相关性。研究MRSA的本地和全球流行病学最广泛使用的分子分型方法是脉冲场凝胶电泳（PFGE）。该方法已被证明在医院爆发的调查中非常成功，并已被用于识别具有引起重大暴发和在国内和国际传播的特殊能力的MRSA克隆（流行性MRSA克隆；EMRSA）。PFGE和所有依赖于比较凝胶上DNA片段模式的方法的一个主要缺点是很难比较不同实验室的结果。因此，对于不同实验室所描述的EMRSA克隆的遗传相关性存在相当大的困惑，迫切需要一种方法，该方法允许在不需要交换参考菌株的情况下明确识别EMRSA和强MSSA克隆。

多基因座序列分型（MLST）是一种高度区分的方法，可根据以下序列来鉴定细菌分离物：7个持家基因的450bp内部片段。对于每个基因片段，不同的序列被指定为不同的等位基因，每个分离物由七个持家基因座（等位基因谱或序列类型 [ST]）中的每个等位基因定义。由于7个基因座中的每一个都有许多等位基因，分离株极不可能偶然具有相同的等位基因谱，具有相同等位基因图谱的分离株可以被指定为同一克隆的成员。序列数据很容易在实验室之间进行比较，MLST的一个主要优点是能够通过互联网比较不同研究中获得的结果。此外，MLST获得的数据可用于解决有关细菌物种进化和种群生物学的基本问题。

MLST已被开发用于鉴定脑膜炎奈瑟菌的致病谱系，并将肺炎链球菌菌株标记为主要的高毒力克隆和主要的青霉素耐药和多重抗生素耐药克隆。在本报告中，我们描述了金黄色葡萄球菌MLST方案的开发和验证，并通过鉴定来自严重社区需求和医院获得性感染患者的155个最近分离株中的MRSA和MSSA克隆，证明了该方法的实用性。

材料和方法

细菌分离物

我们从1997年或1998年在英国牛津地区发现的侵袭性金黄色葡萄球菌病患者中选择了155个连续的细菌分离物。侵袭性金金色葡萄球菌病被定义为在具有与金黄色葡萄杆菌感染相一致的临床体征和症状的患者中，从正常无菌部位分离出有机体。排除了与假体材料相关的深度局部感染患者的分离物，以及仅从一个血培养瓶（至少两个已接种的）中分离出金黄色葡萄球菌的败血症患者的分离。根据临床细节将患者分为两组：社区获得性疾病组和医院获得性疾病患者。社区获得性疾病被定义为与侵袭性金黄色葡萄球菌病一致的疾病，需要入院治疗，并导致在入院24小时内从正常无菌场所采集的样本中分离出金黄色葡萄杆菌。此外，在过去6个月内因任何原因住院的患者被排除在这一类别之外。155株分离株中，61株来自社区获得性疾病患者，94株来自医院获得性疾病。140个分离物来自血液培养物，另外15个来自侵袭性金黄色葡萄球菌病患者的深脓样本。通过阳性管凝固酶和DNase测试，证实分离物为金黄色葡萄球菌。通过测量生物的苯唑西林MIC来测定对甲氧西林的耐药性。这是通过使用苯唑西林E试验（AB Biodisk，Solna，Sweden）完成的，其耐药性定义为2ug /ml的最低抑菌浓度。

MLST

14个管家基因的DNA序列由SmithKline Beecham的M.Burnham提供。用BlastP（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast.cgi）将它们的基因产物与EMBL/GenBank数据库中的序列进行比对，并对肺炎球菌蛋白及其同源物的氨基酸序列进行比对，确定最具变异区。利用多变区两侧高度保守区的序列设计了引物。每对引物都扩增了管家基因的一个内部片段（约500bp），并对两条链上每个基因的450bp片段进行了测序。

在最终的MLST方案中使用了以下7个管家基因，并使用表1所示的引物扩增了这些片段：氨基甲酸激酶（ARCC）、莽草酸脱氢酶（ARE）、甘油激酶（GLP）、鸟苷酸激酶（GMK）、磷酸乙酰转移酶（PTA）、磷酸丙糖异构酶（TPI）和乙酰辅酶A乙酰转移酶（YqiI）。

染色体DNA的提取采用Jordan和Pennington的方法，但在细胞裂解阶段加入终浓度为30g每毫升的溶葡萄球菌酶（Sigma）对该方法进行了改进。采用50ul反应体积，包含0.5uL的染色体DNA（约0.5ug）、0.5ug的每个引物、1U的TaqDNA聚合酶（英国的Qiagen，Crawley）、5ul的10X缓冲液（与Taq聚合酶一起提供）和0.2 mM脱氧核苷三磷酸盐（Perkin-Elmer应用生物系统公司，加利福尼亚州福斯特城）。聚合酶链式反应在PTC-200DNA引擎（MJ Research，波士顿，马萨诸塞州）中进行。首先在95℃变性5分钟，然后在55℃1分钟，72℃延伸1分钟，95℃变性1分钟，最后72℃延伸5分钟，30个循环。扩增产物用20%聚乙二醇-2.5M氯化钠沉淀扩增产物，再悬浮在冷的70%乙醇中并再沉淀；并用ABI Prism 377 DNA测序仪和BigDye荧光终止剂以及初始PCR扩增中使用的引物测定两条链的序列。

对于每个基因座，比较了从所有155个分离株获得的序列，并为不同的序列分配了等位基因编号。对于每个分离株，七个位点中的每个位点的等位基因定义了与其ST相对应的等位序列。通过使用Sta-tistica（StatSoft，Tulsa，Okla.）从分离株等位序列之间的成对差异百分比矩阵中使用算术平均数（UPGMA）通过未加权对组方法实现分离株的聚类。通过Sawyer的方法检查了每个基因片段序列上可变位点分布的非随机性。通过使用序列输出（一种Macintosh程序，可从MLST网站获得）显示多态位点 (http://mlst.zoo.ox.ac.uk).。

PFGE

金黄色葡萄球菌的染色体DNA在琼脂糖块中制备，并通过Bannerman等人的方法用SmaI切割。（2）样品在0.5% TBE缓冲液（44.5mM Tris，44.5mM硼酸盐，1mM EDTA）中的1%琼脂糖凝胶上，在CHEF DR-III PFGE系统（Bio-Rad，Hemel-Hampsted，Herts-fordshire，United Kingdom）上运行，初始切换时间为1s，持续12小时，然后使用6V cm的电压，初始切换速度为15s，持续30秒。（3）使用串联噬菌体λDNA（新英格兰Biolabs，马萨诸塞州贝弗利）来提供分子大小标记。

MecA的检测

通过使用引物MR1和MR2来确定mecA的存在，引物用于PCR以扩增基因的1339bp内部片段。在95℃、55℃和72℃下分别进行1min、1min和2min的30个循环PCR实验。

核苷酸序列登录号

本研究中使用的7个基因座的每个等位基因的DNA序列已在GenBank中保存，编号为：AJ252295-2310、AJ271251-89、AJ271387-403和AJ271482-510，可从上述网站下载。

结果

这七个管家基因片段的序列

对来自不同地理位置的10个金黄色葡萄球菌菌株的14个管家基因片段进行了测序，并选择了提供最多等位基因的7个基因片段用于MLST方案。然后对牛津郡地区侵袭性疾病患者最近分离的155株金黄色葡萄球菌的这7个管家基因片段进行了测序，它们的长度在402到516个核苷酸之间（表2）。对于每个分离株，将七个基因座中的每一个获得的序列与其他分离株的序列进行比较，并对等位基因进行连续编号。序列被指定为不同的等位基因，即使它们在单个核苷酸位点上不同；没有应用加权来反映等位基因之间核苷酸差异的数量。

每个基因座存在11个等位基因（glpF和gmk）和17个等位基因（arcC和aroE）（表2），每个基因座平均有14.4个等位基因，这允许区分>100×106个ST。金黄色葡萄球菌基因相对一致；七个位点的多态核苷酸位点的数量在13（gmk）和23（aroE）之间变化。图中显示了两个最均匀和两个最多样的基因片段内的多态性位点。图1序列的目视检查表明，每个基因片段的多态性位点分布是随机的，Sawyer所述的试验证实了这一点。

金黄色葡萄球菌MLST方案的验证

表3显示了155株金黄色葡萄球菌分离株中鉴定的53种不同等位基因或ST。MLST方案通过从包含多个分离株的17个ST中选择一对分离株并通过PFGE检查从每对染色体DNA获得的SmaI片段的相似性来验证。对于包括MRSA和MSSA分离物的ST12和22，选择的一对是MRSA，一对是MSSA。8对分离物的SmaI PFGE指纹如图所示。图2对分离株（ST34）中的一对具有5个片段差异，但其他对（包括由MRSA和MSSA分离株组成的两对）在4个片段或更少的片段上存在差异。

根据MLST数据构建的树状图，似乎相对密切相关的ST分离株之间也观察到SmaI片段模式的相似性（图3）。例如，ST30和34（5个或6个片段差异）、ST30和36（2到5个片段的差异）以及ST45和49（4到7个片段的不同）的分离株通过PFGE显示出明显的相似性（图2）。相比之下，在树状图上看似远亲的ST分离株显示出大量片段差异。例如，通过MLST，ST25和30在所有7个位点上具有不同的等位基因，ST39和45在7个位点中的6个位点上不同（表3）; 通过PFGE，这两对ST的分离物之间至少有20个片段差异（图2）。

侵袭性金黄色葡萄球菌分离株的聚类。

图3显示了由155个分离株的等位基因谱之间的成对差异矩阵构建的树状图。ST36含有最多的分离株，其中22株均为MRSA。第二大簇是ST30。ST30的17个分离株均为MSSA，并且在基因型上与ST36的MRSA分离株密切相关，因为它们的等位基因型仅在一个位点（pta）不同。其他9种ST由至少5种分离株代表。除ST36（仅包括医院获得的MRSA分离株）外，所有11种流行的ST均以从社区获得性感染患者和医院获得性感染的患者中回收的分离株为代表。

11个流行ST中的9个是克隆复合物的一部分，其中包括流行ST的分离株和密切相关的分离株，其等位基因图谱仅在单个位点与流行ST的图谱不同（图3；表3）。在三种情况下，克隆复合体包括更多的STS，其等位基因图谱仅在一个两个座位上彼此不同（图3；表3）。例如，STS 29至38的分离株（见下文）是一个大聚集群的一部分，该集群包括155个分离物中的48个（31%），其中包括两个主要的STS。类似地，STS 44至48和STS 14至18分别包括14个和10个密切相关的分离株。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分离株分析

155株细菌中，29株（19%）耐甲氧西林，126株（81%）耐甲氧西林。只有一株MRSA分离株是从一名社区获得性感染患者那里获得的。本研究确定的主要克隆（ST36）包括22株MRSA分离株。其中11株MRSA被提交给中央公共卫生实验室（Colindale，伦敦，英国），并被PFGE指定为EMRSA-16克隆的成员。EMRSA-15和EMRSA-16是近年来在英国医院发现的最常见的MRSA克隆。确定了中央公共卫生实验室的B.Cookson提供的EMRSA-15（菌株90/10685）和EMRSA-16（菌株96/32101）参考菌株的等位基因图谱。EMRSA-16参考菌株的等位基因图谱与ST36的22株MRSA分离株的等位基因图谱相同。

类似地，EMRSA-15参考菌株的等位基因图谱与ST22的分离株相同。ST22包括四个MRSA分离株，包括收集的唯一一个是社区获得的，以及四个MSSA，其中三个是社区获取的。

只有三个MRSA分离株不属于ST36（EMRSA-16）或ST22（EMRSA-25）。其中两个分离株（属于ST35和ST38）与EMRSA-16非常密切，因为它们仅在一个基因座上不同，并且被认为是EMRSA-116的小变体。另一个MRSA分离株（属ST12）与四个MSSA分离株的集群无法区分，并且与我们检查的MRSA克隆的任何参考菌株都不相似。

对包括MRSA和MSSA分离物的两个ST的所有分离物（STs 12和22）以及至少两个含有MRSA分离物其他ST的成员测定mecA的存在。所有测试的MRSA分离株均含有mecA基因，而MSSA分离株中未检测到该基因。

甲氧西林金黄色葡萄球菌分离株分析

本次调查中收集到的大多数侵袭性金黄色葡萄球菌分离株（126株；81%）均为甲氧西林敏感株，它们占所有社区获得性感染的98%和所有医院获得性感染中的70%。在收集的155个分离株中，有60个社区获得的MSSA分离株和66个医院获得的MSSB分离株。

大多数MSSA分离株（71%）具有与至少一个其他MSSA分离物相同的等位基因谱，17个ST中有14个包含完全由MSSA分离体组成的多个分离物。医院获得的和社区获得的MSSA分离株之间没有明显差异。由至少三种MSSA分离物代表的所有11种ST均包含来自医院获得性感染患者和社区获得性感染的患者的分离物（图。（图3）.3）。分离物最多的MSSA克隆包含17个（ST30）、12个（ST25）、8个（ST8和ST39）和7个（ST1和ST5）分离物，占本研究MSSA分离物的47%。

英文原文：

Enright MC, Day NP, Davies CE, Peacock SJ, Spratt BG. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol. 2000 Mar;38(3):1008-15. doi: 10.1128/JCM.38.3.1008-1015.2000. PMID: 10698988; PMCID: PMC86325.