探针的标记

①:探针标记的反应体系(1.75pmol/μl) 2μl

T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1μl

Nuclease-Free Water 5μl

[γ-32P]ATP (3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1μl

T4 Polynucleotide Kinase (5-10u/μl) 1μl

总体积 10μl

②:使用水浴或PCR仪37℃反应10min.

③:加一定体积的终止液、混匀、终止探针标记.

④:加入一定体积的TE、混匀.

探针的纯化(视情况定）

对于100μl标记好的探针，加入一定量的醋酸铵和无水乙醇

在-70℃沉淀1h或在-20℃沉淀过夜

在4℃12000g-16000g 离心30min 弃上清

在4℃12000g-16000g 离心1min、吸去残余液体

加入一定体积的 TE ,使沉淀溶解

探针使用时间一般不超过3天，保存在-20℃

市场上也有比较成熟的探针标记的试剂盒可供选择。

EMSA胶的配制

选择灌制较薄胶的模具

按照如下配方配制4%的聚丙烯酰胺凝胶

TBE buffer (10X) 1.0ml

ddH2O 16.2ml

Acr/Bis 2ml

80% 甘油 0. 625ml

10%AP 0.150ml

TEMED 0.01ml

EMSA结合反应

按如下分组进行实验

按照上述顺序依次加入各种试剂，室温放置10min ，加入标记好的探针，混匀，室温放置20min

上样，溴酚蓝的量尽可能少，能看到蓝颜色就可以。

电泳：

10v/cm 预电泳、10min

10v/cm、 温度≤30℃、溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳

放射自显影 干燥EMSA胶 X光片压片检测

实验结果

实验分组的问题进行简要说明：

问：EMSA实验为何需要设置许多组对照实验?目的何在?

EMSA实验1,阴性对照反应(标记探针)；2,常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)；3,探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记探针)；4,突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记突变探针)；5,Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋目的转录因子的特异抗体).

答：每个对照组的目的：

1.看光有探针,没有其他成分时,探针的位置,应该位于最下方.不然说明探针里面有杂质,影响电泳

2.这个是看蛋白和探针的结合,是实验目的

3.看探针结合的特异性.如果冷探针可以竞争结合,阻碍了标记的探针,说明2中的结合是特异的

4.目的和3相同.突变的冷探针应该对2的结果没有影响

5.也是判断特异性,这次是看蛋白的特异性,和抗体结合后,就会有super-shift.如果没有,说明是其他的蛋白结合.

目前EMSA实验中常用的探针为非放射性探针，那么探针设计中应该注意的问题有哪些呢？

1.文献查找与分析：1）如果利用实验者自测的基因序列做EMSA，需要对其进行分析寻找TF结合序列，并与文献进行比对。2）在文献中可以查到大多数TF的结合序列，但最好进行交叉验证以防出错。3）需要注意文献发表的探针序列可能并不适合做非放射性EMSA。

2.探针设计：须注意1）防止探针封闭成环，2）防止错位配对，3）排除目标序列以外结合位点的，4）防止产生空间位阻，5）适当考虑AT/GC比例，6）一般EMSA探针只有几十碱基对。探针太长会产生过多结合位点导致结果分析困难，还会产生超级螺旋结构而掩盖结合部位。

3.核酸合成：1）合成量不能太少，量太少不准确，易产生多余的单链。2）需要HPLC纯化。3）如果是RNA探针，要防止降解。

4.生物素或荧光标记：1）建议采用Biotin或红外荧光标记，尽量不要采用DIG标记。2）标记只能在探针末端。3）为提高灵敏度，尽量探针两端都有标记。

5.双链制作：对配对的单链需进行仔细计算，确保互补链为等当量反应。探针中的多余单链所引起高背景，使非特异带增加，致结果分析困难。

6. 比活性测定：新制作的探针需要稀释后才能直接用于EMSA。稀释度是通过将新探针做不同稀释度后与已知量探针进行比活性测定来确定的。

7. 制作应用液：按比活性确定稀释倍数，用TE稀释制作探针应用液，-20保存。

实验中常见的问题：

1、为什么看不到迁移带？

1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。

2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。

3）探针与蛋白无特异性的相互作用。

4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。

5）曝光或者成像时间过短。

6) 在 Super-Shift EMSA 测定中看不到 Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可能有以下原因：

a. 抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于 Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于 Super-Shift EMSA。

b. 测定的活化的 DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到 Super-Shift 的带，也看不到 DNA/蛋白复合物的量的减少。

c. 使用的抗体过度稀释。一般 10～20 ul 的反应液需要使用 0.5～1 ul 原倍的抗体。

d. 多抗与 DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到 Super-Shift 的带，但应当可以看到 DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。

2、为什么实验背景高？

1）曝光或者成像时间过长。

2）封闭时间不足或者效率不高。

3）洗涤效果不佳。

4）实验过程中膜没有一直处于湿润状态。

3、EMSA 测定需要多少量的蛋白与标记的探针？

对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作优化：一般所用纯化蛋白的量在 20～2 000 ug 间，用粗制核抽提液，需要 2～10 ug 蛋白形成特异的复合物。部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在 -80 ℃、探针应保存在 -20 ℃ 以防止降解。

无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。

4、用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针分离开？

将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为 6%，在特定条件下可用高或低的浓度。也可将 TGE 缓冲液（12.5 mM Tris，pH8.3，95 mM 甘氨酸，0.5 mM EDTA）用于不稳定的蛋白/DNA 复合物。在 4 ℃ 进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。

5、Poly(dI:dC)，非特异性竞争 DNA，特异性竞争 DNA 在 EMSA 测定中的作用？

Poly(dI:dC) 由肌苷和胞嘧啶组成。在 EMSA 反应中加入 poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液中转录调节因子与标记探针的非特异结合。结合溶液中的 poly(dI:dC) 的用量需在正式实验前进行优化，一般用量大约在 0.05 mg/ml 左右。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入 poly(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过 50～100 ug。对核抽提液，每 2～3 ug 核抽提液用 1 ug poly(dI:dC)。返回搜狐，查看更多