一、实验假说

本文投的期刊虽然高大上，但里面所涉及的实验却很简单，在一般实验室就能做到。下图就是本文的提纲。

蓝色部分介绍了现有的络氨酸酶抑制剂TKI耐药性的临床进展。现在临床上用的TKI在一段时间后就会产生耐药性，产生的原因是因为基因突变。而在红色部分的基础研究中发现，非可逆性的TKI——PF299804在高浓度的时候可以逆转耐药性。目前，对于耐药机制的研究60%是突变型耐药机制，但剩下40%的研究就比较少，而这篇文章就选择研究非突变型介导的TKI。这里作者就提出两种假说：

1、短期暴露下，高浓度的不可逆性TKIs和突变选择性抑制剂通过IGF1R通路产生抗性；

2、长期暴露下，高浓度的不可逆性TKIs和突变选择性抑制剂通过IGF1R和ERK通路共同产生抗性；

其中长期暴露的机制更有临床应用意义。

二、结果解读

Fig1~Fig3作者主要进行了短期耐药的研究，初步发现了非突变型耐药通路；

Fig4、Fig5中则是长期耐药的研究，发现了另外的影响通路。

Fig1中作者筛选了耐药细胞株，并找到了一个明星通路PI3K/AKT。

耐药细胞株筛选：PF和WZ以一定浓度暴露4-6月，挑选耐药细胞后再暴露5代

结果都是用MTS方法测定筛选出的耐药株，Fig1A是PF药物耐药株，耐药株IC50是敏感株（PC9）的100倍。Fig1B是WZ药物耐药株，耐药株IC50是敏感株的10倍。

得到了耐药株后，就要找出发生了变化的分子，来寻找介导耐药的通路。作者选择了EGFR、AKT和ERK1/2这3个分子，用WB检测加入PF和WZ 6h后，这3个分子在敏感株和耐药株中的变化。

加入PF和WZ后，AKT的磷酸化水平与EGFR和ERK1/2相比，有着明显的区别。这两个结果说明了PI3K/AKT通路在PF和WZ介导的耐药株中起着关键的作用。

在Fig2中作者要找出PI3K/AKT通路的上游分子，通过加入PI3K/AKT上游分子IGF1R抑制剂BMS536924（1μmol/l）后检测药物敏感性来筛选。药物敏感性的检测方法还是用了Fig1的MTS方法，观察加入BMS536924共同暴露后 72h后，PFR3和PFR5敏感性的变化。

可以看到在加入抑制剂后，药物的敏感性显著增加了，说明IGF1R被抑制后逆转了耐药性。初步证明了IGF1R是PI3K/AKT通路的一个上游分子。

接下来，作者用了另外一个表型实验——细胞克隆实验检测来检测加入BMS536924共同暴露后 2周后，细胞克隆能力的改变。其结果与上面的实验一样。

然后是用WB进行分子检测，进一步证明结论。

在Fig3中作者要找IGF1R的上游分子，这次用了基因芯片的方法。分别检测了敏感株和耐药株中基因变化差异，Western blot 法验证基因芯片结果。

基因芯片做出的结果，有的上升，有的降低，那怎么才能找到目标分子呢？本文作者发现，IGFBP3是IGF1R主要的载体蛋白，它的变化就很有可能会影响其表达的变化，而且相关研究指出IGFBP3参与EGFR野生型细胞获得性耐药机制调节。

结果发现在耐药株中IGFBP3的表达水平是显著降低的，接着作者还是用了上面那套MTS方法、细胞克隆方法和WB来检测细胞敏感性变化，证实了IGFBP3可以影响PF和WZ的耐药性。

WB实验检测下游分子表达

至此，作者就找到了非突变型TKI产生耐药的新通路。

Fig4开始长期暴露的耐药性机制研究，也是从筛选耐药细胞株开始。

长期筛选方法，在前期获得的耐药细胞株中PFR3中不添加PF继续培养20代，获得新的PFR3将其视为短期耐药细胞株；添加PF继续培养20代获得PFR3+将其视为长期耐药细胞株。

然后还是MTS检测，验证了PFR3/WZR4和PFR3+/WZR4+ 细胞耐药机制不同，可能存在其他通路介导。

WB的检测结果也是如此，在PFR3+细胞中加入BMS后，p-AKT表达量依然下降，但是下降的幅度降低，ERK1/2表达上升。

Fig4D中，作者检测了多重耐药产生的时间点，结果是在PFR3+细胞中，PF+BMS共同暴露15代之后，产生多重耐药。

Fig5A中作者用表型实验（MTS法和克隆形成实验）验证在PF作用下，PFR3+比PFR3细胞增殖能力强。

Fig5B加入了抑制剂，逆转了长期耐药。

ERK抑制剂（CI-1040）和IGF1R抑制剂(BMS536924)

三、套路分析

抗性细胞筛选

筛选时间：4-6个月

细胞类别：长期抗性、短期抗性

短期暴露机制

表型：MTS 、克隆形成

机制：抑制剂、基因芯片、WB

分子：miR-X、靶基因、PI3K/AKT

长期暴露机制

表型：MTS 、克隆形成

机制：抑制剂、基因芯片、WB

分子：miR-X，靶基因、ERK1/2

当然，还可以把长期耐药机制换成动物实验，用来在体内证明短期暴露的机制。

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