本发明涉及生物技术领域中植物组织培养技术领域，具体而言，涉及芋头茎尖组织培养中外植体消毒培养的方法及植物植株。

背景技术：

芋[Colocasia esculenta(L.)Schott]，是一种重要的蔬菜和药用植物,在我国具有悠久的栽培历史。芋还是迄今发现的耐盐性最强的蔬菜类作物之一,长期栽培可以降低土壤的盐渍化程度,对滩涂的开发和利用具有较大的应用价值。

全球芋头种植面积最大的是非洲，非洲芋头种植的面积占全球芋头种植总面积的79.9％；而亚洲种植面积占全球芋头种植总面积的7.6％，主要种植地点集中在中国、日本、菲律宾、泰国等。中国的槟榔芋产区主要分布在广西、广东、海南、福建，湖北、浙江、山东、四川、江西等地，并以多子芋为主，著名品种有广西荔浦芋、福建福鼎芋、广东乐昌炮弹芋、靖江香沙芋等。

近几年，由于种植结构调整和人们对芋头产品的青睐，芋头种植面积大幅度提高，出现供需两旺的势头。芋头是无性繁殖作物，以球茎作为生产用种，农户常年留种种植，连续栽培易引起病理性和生理性退化。芋头退化是由病毒侵染并在芋块内累代积留引起的，表现为产量和品质的明显降低。大部分病毒不能侵染芋头茎尖组织，因而通过茎尖组织培养脱毒种芋，将脱毒种芋应用于生产是防止芋头退化的有效措施。在植物组织培养过程中对植物外植体消毒灭菌的效果是植物组织培养成功的关键。污染是造成组织培养失败的主要原因之一，很多学者在初代培养阶段，很难得到无菌苗；或者虽然在初代培养得到了无菌苗，但在继代培养时往往出现大量污染甚至全部污染。

如何降低成本是提高经济效益的首要问题，因此,组织培养中降低污染率是工厂化生产中不可忽视的技术环节。在植物组织培养过程中,存在两种类型的污染：一类是通常所说的污染，即外植体消毒不彻底,无菌操作和培养过程中而导致的污染；另一类是包括真菌和细菌的内源菌污染，这也是造成内源污染的主要原因。外植体污染是组织培养中众多污染途径中最难解决的一个。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的第一目的在于提供一种芋头茎尖组织培养中外植体消毒培养的方法，所述方法中，通过在培育过程中，对外植体采用适宜的方法进行消毒，从而能够有效避免茎尖组织培养中外植体受到污染，同时还能够保证较高的分生组织诱导率。

本发明的第二目的在于提供一种植物植株，所述植株由本发明方法培育得到。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种芋头茎尖组织培养中外植体消毒方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将从采集的母芋上选取的子芋浸泡于杀菌剂溶液中消毒后，埋于砂床中催芽；

(2)待发出的芽体长至15～20cm后，将子芋从沙盘中取出，并在清洗和除去子芋外皮后，晾干备用；

(3)以酒精擦洗子芋和芽体，然后去除茎尖周围的叶片和组织，并截取2～3cm的芽体；

将截取的芽体依次用酒精和二氯化汞溶液消毒，然后清洗并干燥；

(4)剥除干燥后的芽体上生长点外围包裹的叶片；选取生长点上部的组织，并诱导培养。

可选的，本发明中，步骤(1)中所选取的子芋的质量为35～70g。

可选的，本发明中，所述杀菌剂溶液为50％多菌灵可湿性粉剂300～500倍液。

可选的，本发明中，步骤(1)中所述浸泡的时间为15～30min。

可选的，本发明中，步骤(1)中还进一步包括每隔3～5日浇水，并保持沙盘湿润的步骤。

可选的，本发明中，步骤(3)中所述以酒精擦洗子芋和芽体，是以浓度为75～80％的酒精擦洗子芋和芽体。

可选的，本发明中，步骤(3)中所述依次用酒精和二氯化汞溶液消毒，是以浓度为60～70％的酒精消毒2～3min后，再以二氯化汞溶液消毒6～10min。

可选的，本发明中，所述二氯化汞溶液为溶有吐温20的浓度为0.1～0.3％的二氯化汞溶液。

可选的，本发明中，所述诱导培养所用培养基为添加有BA、NAA以及2～3％蔗糖的基础MS培养基；

其中，BA的浓度为2～3mg/L，NAA的浓度为0.1～0.2mg/L。

同时，本发明还提供了由本发明所述方法培养得到的芋头植株。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明中，通过在芋头茎尖组织培养过程中，对外植体(即采集选取得到的子芋和发芽所得芽体)进行反复消毒，并筛选最优的消毒方法、优化消毒的条件，从而能够有效降低芋头茎尖组织培养过程中的污染率，同时还能够保证茎尖顶端分生组织的高诱导率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为外植体预培养砂培催芽示意图；

图2为外植体清洗示意图；

图3为外植体清洗晾干示意图；

图4为芽体前处理示意图；

图5为诱导出芽示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

本发明中，培育所用基材芋头属天南星科芋属植物，是一种多年生块茎植物，其球状地下茎(块茎)可食用亦可入药。芋头的叶片呈盾形，叶柄长而肥大，绿色或紫红色；植株基部形成短缩茎，逐渐累积养分肥大成肉质球茎，称为“芋头”或“母芋”，球形、卵形、椭圆形或块状等。母芋每节都有一个脑芽，但以中下部节位的腋芽活动力最强，发生第一次分蘖，形成小的球茎称为“子芋”，再从子芋发生“孙芋”，在适宜条件下，可形成曾孙或玄孙芋等。

进一步的，本发明中，首先在10～12月份，在无病害的芋田里采摘母芋，并选择生长健壮、头大而圆、顶芽饱满、无病虫、无伤口而且没有腐烂子芋的母芋；

然后，在所采摘的母芋上，选取头大尾小、有顶芽、无病虫眼而且无烂尾的子芋，子芋单个重量范围为35～70g，优选的，子芋的单个重量以40～60g为宜；

选取的子芋进一步在沙床上培养，培养所用沙床最好为洁净、且未使用过的沙床，这样能够有效避免可能的病毒和细菌对于子芋的污染。

然后，配置杀菌剂，杀菌剂优选为50％多菌灵可湿性粉剂300～500倍液，例如可以为，但不限于50％多菌灵可湿性粉剂的350、400或者450倍液；

接着，将选取的子芋在杀菌剂中浸泡15～30min消毒，例如可以，但不限于浸泡18、20、25min等，进行充分消毒；

然后，将消毒后的子芋埋于沙床中进行催芽，较优选的，可以将消毒后的子芋浅埋于沙床中进行催芽，这样更有利于子芋的发芽；

子芋埋于沙床中后，每隔3～5d对沙床浇水，从而保持沙床湿润，同时也为子芋发芽创造良好的生长环境；

当子芋催芽后所生长出的芽体生长至15～20cm后，将生芽的子芋从沙床中小心的取出，避免新芽受伤；

然后，用自来水将子芋外表的沙子冲洗干净，同时，用刷子刷掉子芋的褐色表皮；接着，将子芋摊在筛子上过夜晾干，备用。

接着，是对晾干的子芋的消毒处理，首先是用经过灭菌的纱布蘸取浓度为75～80％的酒精液擦洗子芋和芽体，例如可以蘸取浓度为76、77、78或者79％的酒精后，擦洗子芋和生长出的芽体；

然后，去除所生长出芽体的茎尖周围的叶片和组织，并截取2～3cm芽体作为进一步实验的基材；这一步骤中所截取的芽体，是以去除了周围的叶片和组织后的茎尖为起点，然后沿芽体方向延伸2～3cm的芽体结构，即包含茎尖的芽体；

再接下来，是对通过截取得到的芽体进行进一步的消毒，这一步骤的消毒优选的是在无菌操作台上进行的，这样也能够有效避免芽体受到污染。

这一步骤中，首先是以浓度为60～70％的酒精对截取得到的芽体进行2～3min的消毒，例如可以以62、65、67或者69％浓度的酒精对截取得到的芽体消毒2、2.5或者3min等；

然后，将酒精消毒后的芽体再以含有吐温20的二氯化汞溶液进行消毒，所述溶液中。二氯化汞的浓度优选的可以为0.1、0.2或者0.3％等；使用二氯化汞进行消毒的时间可以优选的为6、7、8、9或者10min等；

二氯化汞溶液消毒后，将芽体以无菌水冲洗5～10次，例如可以冲洗5、6、7、8、9或者10次等；将冲洗后的芽体用无菌滤纸吸去表面的水分，即完成了芽体的消毒。

在子芋消毒处理步骤中，较为优选的选用消毒后的工具、装置和仪器进行各个步骤的操作，在消毒处理过程中，也要尽量避免材料与不洁环境的接触，这样能够更好的避免在处理过程中对外植体的污染。

最后进行的就是接种和培养的步骤。

在这一步骤中，首先要将所要进一步培养的外植体从消毒处理后的芽体上摘取出来，较为优选的，可以在解剖镜辅助条件下，由外向内，依次剥除芽体上的生长点外围所包裹的叶片，直至生长点暴露出来；

然后，使用解剖针，挑取生长点上部0.5mm左右大小的组织，作为进一步培养的材料，并接种于培养基中进行培养；

该步骤中，所用培养基为添加有BA、NAA以及2～3％蔗糖的基础MS培养基；所述培养基中，BA的浓度可以为2～3mg/L，NAA的浓度可以为0.1～0.2mg/L，培养基的pH可以调整至5.8～6.0；培养的温度可以控制在25～27℃，并在暗室等暗环境中进行培养，并最终得到植物植株。

进一步的，本发明中，芋头茎尖组织培养中外植体消毒培养的整体步骤方法如下：

(1)将从采集的母芋上选取的子芋浸泡于杀菌剂溶液中15～30min消毒后，埋于砂床中催芽，期间每隔3～5日浇水保持沙盘湿润；

其中，子芋的质量为35～70g，所用杀菌剂溶液为50％多菌灵可湿性粉剂300～500倍液；

(2)待发出的芽体长至15～20cm后，将子芋从沙盘中取出，并在清洗和除去子芋外皮后，晾干备用；

(3)以浓度为75～80％的酒精溶液擦洗子芋和芽体，然后去除茎尖周围的叶片和组织，并截取2～3cm的芽体；

将截取的芽体用浓度为60～70％的酒精消毒2～3min后，再以含有吐温20的0.1～0.3％的二氯化汞溶液消毒6～10min，然后清洗并干燥；

(4)剥除干燥后的芽体上生长点外围包裹的叶片；选取生长点上部的组织，并诱导培养；

培养所用培养基为添加有BA、NAA以及2～3％蔗糖的基础MS培养基；培养基中BA的浓度为2～3mg/L，NAA的浓度为0.1～0.2mg/L。

实施例1

(1)外植体的采集：

在10月～12月间，在无病芋田中选取健壮、头大而圆、顶芽饱满、无病虫、无伤口，同时不带有不腐烂子芋的芋头作为母芋；然后，在母芋上截取头大尾小、有顶芽、无病斑虫眼，同时无烂尾的子芋，单个子芋的质量以40～60g为宜；

(2)外植体的预培养：

准备洁净、未使用过的砂床，用50％多菌灵可湿性粉剂400倍液浸泡子芋20min；

然后，将子芋浅埋于砂床中催芽，期间每隔3～5天浇水一次，保持砂床湿润；

(3)外植体的预处理：

请参考图1，待生发出的芽体长至15～20cm后，将子芋从砂床中小心取出，避免新芽受伤；

然后，请参考图2，用自来水将子芋上沾有的砂子冲洗干净；同时，用刷子刷掉子芋的褐色外皮；然后，请参考图3，将洗净的子芋均匀摊在筛子上过夜晾干备用；

(4)芋头芽体的消毒：

a.芽体的前处理：用经灭菌的纱布蘸取75％的酒精，擦洗整个子芋本体以及生长出的芽体；然后，请参考图4，去除芽体上茎尖周围的叶片和组织，并以去除了周围的叶片和组织后的茎尖为起点，然后以该起点为远点，并沿芽体方向延伸2～3cm截取芽体，得到长度为2～3cm、且包含茎尖结构的芽体；

b.芽体的消毒：无菌操作台下，将截取后的芽体用70％酒精消毒2min；然后，再以含有吐温20的0.1％2氯化汞对芽体消毒8min；接着，以无菌水冲洗芽体5次，并用无菌的滤纸吸去芽体表面的水分；

(5)外植体的接种：

a.外植体的摘取：在解剖镜下由外向内依次剥除芽体上生长点外围包裹的叶片，直至生长点暴露；

b.用解剖针针尖挑取生长点上部0.5mm左右大小的组织,接种到芋头芽诱导培养基中，并在温度为25～27℃的暗室中进行诱导培养，诱导出芽植株请参考图5；

所用培养基为添加有BA、NAA以及2～3％蔗糖的基础MS培养基；其中，BA的浓度为2～3mg/L，NAA的浓度为0.1～0.2mg/L。

实验例1

按照实施例1所述方法，选取100个子芋，然后，按照实施例1步骤(1)-(5)中所述方法进行茎尖组织培养；然后，对茎尖组织培养的污染率和茎尖顶端分生组织的诱导率进行检测。

结果发现，采用本发明方法，即对组织培养过程中对外植体进行消毒处理后，污染率能够控制在3％，茎尖顶端分生组织的诱导率也能够达到95％。

而按照现有的芋头培养技术，并采用与本发明中相同的培养液，在以同样的子芋为基材的情况下，茎尖组织培养的污染率为50％，茎尖顶端分生组织的诱导率仅为70％左右。

本发明中，通过在茎尖组织培养过程中，对所用基材外植体采用合理处理的方法，并在外植体选取、培育和分离过程中，均采用适当的消毒方法对外植体进行消毒，从而能够有效避免在培养过程中外植体被污染，同时还能够有效提高茎尖顶端分生组织的诱导率。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。