蛋白磷酸化是一种重要的细胞信号传导过程，它涉及激酶通过将磷酸基团添加到蛋白质的氨基酸残基上来调控蛋白质的功能。这种修饰作用可以改变蛋白质的结构和活性，从而影响细胞的代谢、增殖、分化等生理过程。蛋白磷酸化在许多生物学过程中发挥着关键作用，对于细胞的正常功能至关重要。磷酸化蛋白的Western blot（WB）检测是一种常用的实验方法，用于检测特定蛋白质上的磷酸化修饰，可以帮助科研人员了解蛋白质在不同生理条件下的磷酸化水平，以及在细胞信号转导途径中的作用和调控。

由于磷酸化蛋白反应快，降解快，表达量少，想跑出好的磷酸化蛋白条带，与普通的 Western Blot 相比，磷酸化WB有很多需要注意的事项。

实验前了解蛋白自身的属性和背景是非常重要的，一般需要查阅文献或通过预实验检测样本是否表达目的位点的磷酸化蛋白。若正常情况下样本的磷酸化水平过低或不表达，可通过物理或化学方法进行一定的刺激和诱导，正确的刺激会帮助得到最佳实验结果，值得注意的是，刺激的时间和强度也需查阅文献和进行预实验来确定。

由图可知，AKT蛋白在未处理的人乳腺癌细胞中会发生Ser473位点的磷酸化，在经过insulin+EGF/U0126的处理后磷酸化显著加强，但LY294002的处理会导致该位点的磷酸化程度显著降低。

01/在磷酸化蛋白提取中的“快准冷”

快，制样快，操作快；

准，实验步骤以及各类试剂添加准确；

冷，全程冰上操作，所有试剂和实验用具均需要预冷，将磷酸化蛋白降解的可能性降到最低。同时需要添加新制蛋白酶以及磷酸化酶广谱的抑制剂，提取的磷酸化蛋白需要尽快变性蛋白并于-80℃分装保存，同时避免反复冻融导致磷酸基团的降解。

另外，为了确定观察到的磷酸化水平改变是否是由于磷酸化程度的改变，或仅仅是因为蛋白质本身表达量的改变，除了常用的内参，例如Actin以及GAPDH等，还需要添加一个总蛋白作为参照，帮助进行将结果分析。

02/Western Blot操作过程中需要注意的问题‍

蛋白定量后，快速将样品与上样缓冲液混合，以遏制磷酸酶活性。随后可以将样本等分并储存在低温冰箱中或直接加样进行WB检测。样本应避免长期储存，最好现配现用。

磷酸化蛋白的丰度较低，大概只有总蛋白量的10%，在实验时尽量增加上样量，避免影响实验结果与判断。有的磷酸化蛋白会特意注明上样前不要煮沸，因为煮沸可能会破坏其磷酸化位点。

封闭液：牛奶中含有大量的一种磷蛋白——酪蛋白，会引起高背景。在进行磷酸化蛋白检测时建议使用牛血清白蛋白BSA或无蛋白的封闭剂，封闭时间不宜过程，1-1.5h即可。

为尽量减少非特异性信号，用 TBST 代替磷酸盐缓冲液（PBS）。如果在中间步骤中必须使用 PBS，则应在加入蛋白检测底物前，用大量 TBST 清洗膜，以除去过量的磷酸钠。

#340763 Phospho-AMPK alpha 1/2 (Thr183/Thr172) Rabbit pAb

问题描述：条带不清晰，背景较深。

原因分析与优化意见：上样体积较小，导致曝光时间增加，背景颜色深。同时，奶粉中含有的磷蛋白会进一步引起高背景。建议上样体积修改为40μL，并使用5%的BSA或者血清进行封闭。

#341468 Phospho-PI3Kinae p85/p55(Tyr467/Tyr199) Rabbit pAb

问题描述：杂带较多，无明显目标条带，背景较深。

原因分析与优化意见：上样体积较小，导致曝光时间增加，背景颜色深。同时，由于将样本长期保存，其中的磷酸化蛋白已经发生降解，无法检测出目标条带。建议新提蛋白，增加上样量，重新进行检测。

#310200 Phospho-LIM Kinase 2 (Thr505) Rabbit pAb

问题描述：完全没有条带。

原因分析与优化意见：未做刺激处理的Hela中该蛋白位点的磷酸化程度很低，且样品上样量较少，保存时间过长，影响实验结果。将样本经过PMA处理后，现提蛋白进行WB检测，能够得到较为清晰理想的结果。（请参考正能官网#310200产品验证图）

综上所述，成功的磷酸化蛋白WB检测往往需要前期扎实的背景调研和细致的实验操作，预实验的重要性在于研究人员可以调整蛋白质抽提、电泳、转膜和免疫印迹等步骤，以优化实验条件并确定最适合的抗体浓度和工作条件，以便成功检测目标蛋白质。这有助于确保后续的实验数据得到正确解释，从而对研究结果的准确性和可靠性产生重要影响。