碱性蛋白酶是指在碱性条件下(pH 9.0-11.0)能够水解蛋白质肽键的酶，是一类内切蛋白酶，催化残基为丝氨酸，在清洁、食品、医疗等多个工业领域有很高的应用价值[1-2]。随着碱性蛋白酶在工业上的广泛应用，特殊功能蛋白酶的需求日益增加，近期研究发现碱性蛋白酶在生物活性肽生产方面有巨大潜力，进一步拓宽了碱性蛋白酶在保健食品领域中的应用。Borrajo等[3]最新研究表明，与其他蛋白酶相比，SubC是最有效的释放生物活性肽的蛋白酶。SubC蛋白酶水解不同蛋白质可以产生不同生物活性肽，这些肽具有抗氧化性[4]、血管紧张素I转换酶抑制[5]、金属结合[6]、抗糖尿病、抗炎和抗菌等活性[7]，以及可改善功能肽食品的感官和营养特性[8]。

芽孢杆菌属的细菌是工业上公认的用于生产细胞外蛋白的微生物。由于可获得相对便宜的大规模生产系统，芽孢杆菌属的细菌被广泛应用生产胞外蛋白[9]。目前，主要生产碱性蛋白酶的芽孢杆菌及研究对象有地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、嗜碱性芽孢杆菌(Bacillus sp.)等[10]。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)是革兰氏阳性细菌的模式菌，其不产生内毒素且有较强的蛋白分泌能力，被美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)认证为安全菌株(Generall Recognized as Safe，GRAS)[11]。此外，枯草芽孢杆菌的分泌表达系统具有一套高效的信号肽和分子伴侣系统，在蛋白表达过程中不易形成包涵体，可以通过改造使目标蛋白产物大量分泌到培养基中，从而促进其分离和纯化[12-13]。枯草芽孢杆菌生长速率快、培养周期短，在大规模发酵过程中可以快速生长到高细胞密度。然而该表达系统也存在许多不足，致使表达水平较低[14]，但通过强启动子、转录终止子、各种分泌信号肽和分子伴侣的最佳组合可实现高水平的蛋白表达[15-16]。

Zhou等[17]对地衣芽孢杆菌2709中与泡沫形成有关的天然lchAC和编码胞外粘多糖的eps簇进行了遗传修饰，同时通过筛选不同模块质粒和基因组基因座中最有效的表达系统进一步优化了碱性蛋白酶基因(aprE)的表达，最终结果表明酶活与野生型菌株相比显著提高了62.19%。张若兰等[18]在酿酒酵母Whu2d中实现了碱性蛋白酶的异源表达，结果表明工程菌发酵液中碱性蛋白酶的酶活比出发菌株高55.2%。Degering等[19]对来源于地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的上百种信号肽进行了筛选和研究，发现地衣芽孢杆菌几丁质酶的信号肽dBli00338可以大幅度提高碱性蛋白酶的分泌表达量。

本研究选用枯草芽孢杆菌作为宿主菌株异源表达地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶，通过筛选宿主菌株和信号肽及优化发酵条件等手段提高碱性蛋白酶SubC在枯草芽孢杆菌中的表达，以期实现重组碱性蛋白酶SubC的工业化生产，从而拓宽其在生物活性肽领域的广泛应用。

菌株、质粒及引物序列的相关特性分别列于表 1-3。

麦芽糖，上海麦克林生化科技有限公司；质粒小提试剂盒、柱式PCR胶回收试剂盒，Omega公司；DNA聚合酶Primer STAR Mix，TaKaRa公司；一步克隆试剂盒(ClonExpress® Ⅱ)、2×Taq PCR Master Mix，南京诺唯赞生物科技有限公司。

PCR仪，Eppendorf公司；凝胶成像系统，Bio-Rad公司；可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；叠加摇床，上海智城分析仪器有限公司。

LB培养基及LB固体培养基的配制见参考文献[20]。2×SR培养基(g/L)：酵母粉50.0，蛋白胨30.0，K2HPO4 6.0。MXR培养基(g/L)：酵母粉24.0，酸水解酪素12.0，树胶4.0，甘油4.0，PBS 100.0。牛奶平板培养基(g/L)：脱脂奶粉20.0，琼脂20.0。

将NCBI中公布的地衣芽孢杆菌来源的碱性蛋白酶SubC (CAB56500.1)序列进行化学合成和密码子优化。根据合成的subCori序列设计引物subCori-F和subCori-R，对目的基因subCori进行扩增并对PCR产物进行胶回收。pMATE质粒是将pMA5质粒的原始组成型启动子PHpaII替换为麦芽糖诱导型启动子PmalA[21]。pMATE表达载体使用同样方法进行构建并用胶回收试剂盒纯化回收，将目的基因片段subCori与表达载体pMATE通过试剂盒进行连接。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，转化菌液涂布到含氨苄西林(Amp) 100 µg/mL的LB平板筛选阳性克隆，完成重组质粒pMATE-subCori的构建。用同种方法构建重组质粒pMATE-subCopt。

将重组质粒采用Spizizen盐化学转化法分别转入枯草芽孢杆菌1A751、MA07和MA08，通过菌落PCR验证阳性转化子，重组菌株1A751-subC、MA07-subC和MA08-subC均按照文献[20]中所述方法进行构建。

以pMATE-subCopt重组质粒为模板进行PCR，将原信号肽从质粒上去除，命名为pMATE-subCopt-dp；然后设计6组信号肽引物，以pMATE-subCopt-dp为模板进行PCR，通过Gibson Assembly无缝克隆方法克隆至pMATE-subCopt-dp (图 1)，得到6个质粒，分别为pMATE-subC-AprE、pMATE-subC-Pel、pMATE-subC-NprE、pMATE-subC-AmyE、pMATE-subC-YoqM、pMATE-subC-YddT。信号肽相关信息如表 4所示。

所有重组菌株在LB琼脂平板和LB液体培养基(培养基中加入相应抗生素)中活化(37 ℃、220 r/min培养14-16 h)。将活化的重组菌株接种到装有2×SR发酵培养基的250 mL锥形瓶中(1%接种量)，每种菌株做2个平行，37 ℃培养48-60 h。重组菌株均在零时诱导，诱导物麦芽糖在摇瓶中的终浓度为质量分数1%、3%、6%、9%。摇瓶培养根据参考文献[20]进行操作。

取发酵液于4 ℃、12 000 r/min离心3 min，取上清，加入5×Loading Buffer后在沸水中煮20 min，室温下冷却。采用12.5%的PAGE凝胶快速制备试剂盒制备凝胶。电泳结束后，添加0.25%考马斯亮蓝染色液染色2 h，脱色后用凝胶成像系统拍照记录。

采用Suc-AAPF-pNA assay方法测定蛋白酶酶活[22]。酶活单位定义为：在37 ℃和pH 8.5条件下，每分钟水解0.1 mmol/L的Suc-AAPF-pNA溶液释放的对硝基苯胺(pNA)在405 nm处吸光值的增加为1个酶活单位，以AU/min表示。

对NCBI数据库中的碱性蛋白酶编码序列subC (来源于Bacillus licheniformis CAB56500.1)进行密码子优化，优化后的subC序列的GC含量从51%变为57%。优化的subC碱基序列(命名为subCopt)与野生型subC序列(命名为subCori)的相似度为79.67%。以全基因合成的subCori和subCopt序列为模板，通过PCR扩增获得目的基因片段。通过组内已有的蛋白表达研究，选择麦芽糖诱导的启动子PmalA代替pMA5的组成型启动子PHpaII[21]，替换后的质粒命名为pMATE。分别将2个目的基因通过Gibson Assembly无缝克隆方法克隆至质粒pMATE的诱导型麦芽糖启动子PmalA序列下游，获得重组表达载体pMATE-subCori和pMATE-subCopt。质粒构建过程中DNA电泳结果如图 2所示。

将测序正确的质粒pMATE-subCori和pMATE-subCopt采用Spizizen化学转化方法分别转入B. subtilis 1A751。为了能快速、直观地筛选阳性单克隆菌株，采用牛奶平板进行筛选。将枯草芽孢杆菌1A751感受态细胞稀释后，加入浓度为0.1% (质量体积分数)的麦芽糖诱导剂，涂于含有50 μg/mL卡那霉素和5% (质量体积分数)脱脂牛奶的LB筛选板上，37 ℃培养过夜，菌落周围有透明圈的转化子为阳性转化子(图 3A)，通过菌落PCR做进一步验证，得到重组菌株1A751-SubCori和1A751-SubCopt。

从牛奶平板可以初步看出，pMATE-subCori和pMATE-subCopt这2种重组质粒在宿主菌株B. subtilis 1A751中均能表达，但表达水平有差异，其中转入pMATE-subCopt质粒的表达菌株具有更明显的透明圈。将菌株1A751-SubCopt和1A751-SubCori活化，接入装有3% (质量体积分数)浓度麦芽糖诱导剂和25 mL 2×SR培养基的250 mL三角瓶中进行摇瓶发酵，发酵周期为50 h。对发酵液上清进行酶活检测，采用Suc-AAPF-pNA作为蛋白酶酶活测定的底物，在37 ℃、pH 8.6的条件下与稀释104倍后的蛋白酶粗酶液反应5 min，然后通过酶标仪测定A405的吸光度。如图 3B所示，1A751-SubCopt的酶活是1A751-SubCori酶活的1.74倍。因此后续实验采用pMATE-subCopt重组质粒进行发酵及优化工作。

选取MATE表达系统宿主B. subtilis 1A751、MA07和MA08作为宿主细胞进行蛋白酶的表达水平验证分析，其中MA08表达强度最大。将pMATE-subCopt质粒采用Spizizen化学转化方法分别转入B. subtilis 1A751、MA07和MA08，采用牛奶平板法初步验证不同宿主细胞的表达强度。从牛奶平板可以初步看出(图 4A)，重组质粒在3种宿主菌株中的表达情况有较明显差异，其中MA08菌株具有更明显的透明圈。

将菌株1A751-SubCopt、MA07-SubCopt、MA08-SubCopt活化，在2×SR培养基中进行摇瓶发酵，0 h加入3% (质量体积分数)麦芽糖进行诱导，50 h对发酵液上清进行SDS-PAGE分析及酶活性检测。由图 4B明显观测到3种宿主菌株均能成功表达目标蛋白，而且与理论预测的蛋白分子量大小(27.5 kD)一致。其中，采用MA08宿主菌株表达的碱性蛋白酶酶量更大且酶活性更强(图 4C)，由此可以比较得出3种宿主菌株的表达强度为MA08>MA07>1A751，这与预期的宿主细胞的表达强度相符。

在上述实验基础上，选择表达强度最大的宿主菌株MA08进行下一步摇瓶发酵优化。为了探究不同诱导剂浓度对碱性蛋白酶分泌的影响，选择质量体积分数分别为1%、3%、6%、9%的4种不同浓度麦芽糖进行诱导。在37 ℃培养条件下，将1%、3%、6%、9%的麦芽糖分别加入到250 mL摇瓶中诱导表达50 h。发酵完成后将4种不同麦芽糖浓度下的胞外培养基上清进行酶活分析，由图 5分析可知，3% (质量体积分数)浓度麦芽糖诱导的蛋白表达强度大于其他3种诱导浓度，而且当麦芽糖浓度高于3% (质量体积分数)时，随着麦芽糖浓度的提高，酶活呈递减趋势。

发酵培养基中营养成分的组成和比例是微生物生长和产酶过程中的重要影响因素。选择2×SR培养基和MXR培养基作对比，考察不同发酵培养基对产酶的影响。MXR培养基与2×SR相比，碳源含量丰富而氮源相对含量较低。结果如图 6所示，摇瓶培养50 h，以2×SR为发酵培养基的菌株，其蛋白酶几乎全部分泌至胞外且表达量较高。以MXR为发酵培养基，菌体不进行蛋白酶的外泌，胞内也只有少量蛋白酶存在，说明MXR培养基的高碳源和低氮源的组成成分和比例不利于枯草芽孢杆菌生产碱性蛋白酶。

选取发酵培养基为2×SR，3% (质量体积分数)麦芽糖诱导50 h的发酵液作为样品进行细胞破碎，对胞内可溶(s)及包涵体(p)部分进行了SDS-PAGE分析(图 7)。结果表明蛋白酶的可溶性表达情况较好，未见包涵体，因此目前限制分泌效率的瓶颈因素主要为信号肽序列的匹配，筛选合适的信号肽是进一步提高分泌表达效率的关键。

选择6种潜力较大的信号肽序列(AmyE、AprE、NprE、Pel、YddT、YoqM)作为初步筛选对象，利用Gibson Assembly的方式将目的信号肽序列替换野生型信号肽序列。将构建完成的6株信号肽重组菌株，采用LB培养基作为种子培养基，发酵培养基采用2×SR培养基并添加50 μg/mL卡那霉素和3%麦芽糖诱导物，于250 mL摇瓶中发酵50 h进行后期的酶活测定工作。采用Suc-AAPF-pNA作为蛋白酶酶活测定的底物，从图 8酶活检测结果可以看出，与携带野生型信号肽的对照组菌株WT相比，只有AmyE和YoqM信号肽菌株表现出酶活提高，其中AmyE信号肽菌株酶活提高最为显著，提高幅度为73.4%，说明AmyE信号肽在促进SubC蛋白酶表达及分泌效率方面具有更好的效果。

在此基础上，进一步对携带WT和AmyE信号肽菌株的胞内外蛋白酶酶活进行了对比，结果如图 9所示。从图 9中可以看出，AmyE菌株的胞内和胞外酶活均高于对照组，其胞内酶活为胞外酶活的54%，对照组胞内酶活为胞外酶活的59%，说明AmyE信号肽对提高蛋白酶向胞外的转运效率具有促进作用，同时结果也表明仍有较多的蛋白酶留存在胞内。

进一步将发酵周期延长至60 h，观察胞外发酵液酶活是否能够进一步提升。结果显示延长发酵时间并未对发酵液上清的酶活有提升作用，其中AmyE作为之前最高的发酵酶活菌株在60 h时其发酵液酶活与50 h相比下降了21.6% (图 10)。

为了探索信号肽序列特性与分泌效率之间的相关性，根据分泌效率(培养基中的SubC碱性蛋白酶酶活)和6种信号肽序列的特性进行不同的分析。使用SignalP 4.1 Web和ExPASy Compute pI/Mw工具计算SubC天然信号肽和枯草芽孢杆菌的6种信号肽的D值和pI值，并针对碱性蛋白酶SubC的酶活性作图以探究它们之间的相关性。图 11结果表明，高效能信号肽的分泌效率与D值或pI值之间并未发现直接相关性。

目前芽孢杆菌生产碱性蛋白酶在国内的研究总体趋势较好，利用基因工程和蛋白质工程可以对菌株及酶基因序列进行定向改造，进而使其达到更高的发酵酶活水平及最适的酶学特性。但国内仍然面临着菌种单一、作用范围窄、性能不足等问题，无法达到国际先进水平。在大规模工业生产应用中，碱性蛋白酶仍然主要依赖进口[23-24]。因此，开发新型碱性蛋白酶进一步提升产能、拓宽应用市场是当前研究的重点[25-26]。

培养基的组成成分和发酵周期均会影响微生物的生长和产物的生产。曹春红等[27]通过优化发酵培养基碳源、氮源的种类和浓度，同时优化发酵时长，使酶活有显著提高，同时降低生产成本。本研究将2×SR培养基和MXR培养基作对比，发现MXR培养基不适合菌株生长，我们猜测过量的碳源供应会引起营养阻遏，微生物不再向胞外分泌过量的蛋白酶，体现了微生物细胞具有环境适应性和代谢经济性。同时发现发酵周期过长会使酶活降低，可能是由于在摇瓶发酵条件下，发酵周期过长导致培养基中的营养物质不断被消耗，在营养物质匮乏的条件下菌株可能以自身产生的蛋白酶为底物进行降解，会导致酶活损失或枯草芽孢杆菌产的一些杂酶对蛋白酶产生一定的降解。

在枯草芽胞杆菌蛋白表达系统中，通过筛选和优化异源蛋白的前导信号肽，可以实现目标蛋白的胞外分泌[28]。由于不同物种信号肽的差异，异源分泌蛋白的天然信号肽与枯草芽孢杆菌内源分泌系统的相容性不一定最佳。Degering等[19]对来源于枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的信号肽做了大量的研究，最终发现在地衣芽孢杆菌几丁质酶的信号肽dBli00338和枯草芽孢杆菌的信号肽sYbdN的指导下，枯草芽孢杆菌TEB1020和地衣芽孢杆菌H402中碱性蛋白酶的分泌和表达会大幅度提升。本实验根据组内已有的研究[12-13]，发现在6种潜力较高的信号肽中，来源于枯草芽孢杆菌的信号肽AmyE使酶活有了明显提高，同时对胞内蛋白进行SDS-PAGE分析发现仍有大量蛋白酶未分泌到胞外。虽然已经有许多关于信号肽特征的研究[29-31]，但是仍然没有快速简单的方法来鉴定最适特定蛋白质的信号肽。为此，我们利用计算软件探究信号肽D值和pI值与蛋白分泌之间的相关性，结果表明它们之间无线性相关性，不能通过软件分析快速筛选得到目标蛋白的最适信号肽。因此我们分析认为通过对信号肽进行建库，扩大信号肽的筛选范围，进行高通量筛选或同时优化蛋白转运元件和分子伴侣的方法会对提高分泌效率有较大帮助。

通过优化地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶基因密码子，本研究成功构建了碱性蛋白酶SubC表达菌株1A751-subC，实现了碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的异源表达；然后，通过宿主菌株的选择和最佳信号肽的添加，构建了碱性蛋白酶SubC表达菌株MA08-AmyE-subCopt，进一步提高了枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶SubC的胞外分泌水平；最后，通过优化发酵条件，重组菌株MA08-AmyE-subCopt的胞外酶活性成功提高到3.33×103 AU/mL，其酶活力与携带野生型信号肽的对照组菌株WT相比，提高幅度为73.4%。异源碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的成功表达，为碱性蛋白酶的表达和工业化应用提供了理论基础。