细菌绝对定量方法总结

背景：目前根据测序得到的微生物的相对含量可以看到微生物的相对变化情况，但是其并不能提供物种丰度变化的程度和方向的信息，忽略了微生物总体变化情况，因此，微生物的绝对定量是非常必要的。这里总结了细菌微生物绝对定量的三种方法，并且进行了比较。

一、通过加入已知量外源菌计算细菌微生物的量

图示为内标法的主要的四个步骤：

1. 内标菌的加入和细菌的裂解（蓝色）

2. DNA的提取、片段的扩增和测序（黄色）

3.  数据预处理（红色）

4.  根据内标菌矫正微生物的量（绿色）。

具体步骤：

①将已知拷贝数的外源细菌加入均一化的微生物样品中

②进行细菌裂解

③DNA提取

④进行PCR片段的扩增

⑤片段的纯化和测序

⑥16S测序数据的上有分析

⑦测序深度抽平（标准化）

⑧根据加入外源细菌的reads数目，估算特定样品的细菌数目。

参考文献：Frank Stämmler, Joachim Gläsner, Andreas Hiergeist, Ernst Holler, Daniela Weber, Peter J. Oefner, André Gessner & Rainer Spang. (2016). Adjusting microbiome profiles for differences in microbial load by spike-in bacteria. Microbiome 4, 28, doi: https://doi.org/10.1186/s40168-016-0175-0

二、通过流式细胞计数法计算细菌DNA的量

具体操作步骤：

1. 将0.2g样品用生理盐水稀释100,000倍，用注射器式滤式过滤去除杂物。

2. 1ml的微生物细胞悬浮液中加入1ul的SYBR GreenI染液进行染色，37℃黑暗孵育15min

3. 用流式细胞仪分析悬液中的微生物细胞量

参考文献：Doris Vandeputte, Gunter Kathagen, Kevin D’hoe, Sara Vieira-Silva, Mireia Valles-Colomer, João Sabino, Jun Wang, Raul Y. Tito, Lindsey De Commer, Youssef Darzi, Séverine Vermeire, Gwen Falony & Jeroen Raes. (2017). Quantitative microbiome profiling links gut community variation to microbial load. Nature 551, 507-511, doi: https://doi.org/10.1038/nature24460

三、运用荧光定量PCR的方法计算细菌DNA的量

具体方法：

1. 将提取的DNA进行16S全长扩增

2. 将胶回收纯化后的产物作为标准品，进行梯度稀释，并计算出其对应的拷贝数。

3. 运用荧光定量PCR的方法扩增细菌的保守片段，制作拷贝数和循环数的标准曲线

4. 根据得到的标准曲线计算其他样品的细菌量

这三种方法优缺点比较

外源菌内标的方法对外源菌的要求较高，必须为所检测的DNA中不存在的菌，并且要求有其特异性探针。流式细胞仪分析计数操作复杂，操作过程或其他因素引起的死亡细胞并没有计入。荧光定量PCR方法操作简单，可行性高，需要对qPCR扩增的保守片段进行探索。

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