昆虫是动物界中最大的类群，对其进行分类鉴定和确立亲缘关系是昆虫学领域的重要研究内容之一。昆虫分类通常依据形态学特征，随着技术手段的更新，生理学、生物化学(南宫自艳等，2014)、遗传学、分子生物学(赵广宇等，2014)、行为学(项兰斌等，2016)等特征也成为昆虫分类的重要依据(彩万志等，2011)。近年来，随着计算机图像处理技术的发展，以昆虫外部形态特征为分类学依据的技术也不断完善，并被应用于多种昆虫的分类鉴定或自动识别中(Macleod，2007；徐鹏等，2010)。

据报道，Tofilski(2004)通过开发的DrawWing获取到昆虫的翅脉特征，实现了黄蜂属Dolichovespula种类的鉴定。随后，利用该软件进行特征提取的对象也被扩展应用到其他目昆虫，如鳞翅目Lepidoptera蝶类的分类鉴定研究(潘鹏亮等，2008b)。Rohlf开发的TPS系列软件不但可以获取节肢动物的形态特征，还可实现强大的分析功能(http://life.bio.sunysb.edu/morph/index.html)，并被应用于双翅目Diptera黑腹果蝇Drosophila melanogaster(Moraes et al., 2004)、膜翅目Hymenoptera小唇泥蜂属Tachysphex(Pretorius，2005)、鳞翅目夜蛾科Noctuidae(蔡小娜等，2016)等昆虫以及激流水螨属Torrenticola(Becerra & Valdecasas，2003)等节肢动物的种类鉴定中。O'Neill(2007)开发的DAISY(the Digital Automated Identification System)也被应用于膜翅目、双翅目、鳞翅目成虫和幼虫以及蛛形纲Arachnoidea节肢动物的鉴定中，误判率低于5%。此外，还有专门用于蜜蜂种群鉴定的ABIS(Automated Bee Identification System)和物种鉴定系统SPIDA(Species Identification Automated)及其网络版(SPIDA-web)等被应用于多种物种的分类鉴定(Macleod，2007)。在国内，中国农业大学IPMist实验室的科研团队对此类技术进行了深入研究，并开发了BugShape 1.0软件，实现了对多种鳞翅目、鞘翅目Coleoptera、半翅目Hemiptera昆虫(赵汗青等，2003；潘鹏亮等，2008a；苏筱雨等，2016)、鼠类(花慧贞等，2016)等的几何形态特征提取。竺乐庆和张真(2013)利用稀疏编码算法和共轭梯度反向传播神经网络对鳞翅目576个样本进行测试，取得高于99%的识别正确率。报道中选择的昆虫个体体型一般在中型以上，而对体型微小的昆虫能否通过此类软件实现相关特征的获取，甚至是对同一科不同属或同一属不同种的小型昆虫，能否利用此类特征进行其种类的区别，进而实现种类鉴定，相关报道并不多见。

因此，本研究选取了半翅目昆虫中体型较小的4种网蝽——悬铃木方翅网蝽Corythucha ciliata (Say)、菊方翅网蝽Corythucha marmorata (Uhler)、梨冠网蝽Stephanitis nashi Esaki et Takeya和女贞高颈网蝽Perissonemia borneenis (Distant)，通过BugShape 1.0对其外部几何形态特征进行了初步提取和相关的统计学分析，试图验证此类参数在网蝽科微小型昆虫分类鉴定中应用的可行性。本研究的结果将为此类害虫远程鉴定和雌雄判别提供方法和依据，有利于害虫种群监测技术的完善。

梨冠网蝽采集于河南省信阳市百花园垂丝海棠Malus halliana，其余3种网蝽均采集于信阳农林学院。采集到的网蝽放入盛有无水乙醇的5 mL离心管中，在实验室利用体视解剖镜(迈特MZS0745，广州市迈特仪器有限公司)辨别雌雄后，分别进行图像获取。

利用爱普生平板扫描仪的内置透扫适配器进行扫描，分辨率设置为1 200 dpi。每种网蝽随机选取雌雄成虫各50头，背面向下放置，进行单头批量扫描，图片以.jpg格式保存。由于本研究中的网蝽体型小，不对足的位置进行整理，触角保持自然伸展状态。每张网蝽图片通过BugShape 1.0处理，参照于新文等(2003)的方法获取网蝽的10个几何形态特征值用于统计分析。

在比较不同种类网蝽和同种网蝽不同性别间各参数的差异性时，分别采用单因素方差分析和独立样本t检验，显著性水平α=0.05。同时，对各数据集进行正态检验和方差齐性检验，方差不齐的数据进行平方根反正弦转换。利用Fisher典型判别分析方法对不同网蝽样本进行判别分析，对4种网蝽雌雄成虫进行分层聚类分析，所有分析均在SPSS 22.0中完成。

单因素方差分析表明，10个参数在4种网蝽间差异均有高度统计学意义：面积(F=391.659，df=3，396，P＜0.001)、周长(F=336.499，df=3，396，P＜0.001)、长轴长度(F=1 449.637，df=3，396，P＜0.001)、短轴长度(F=199.105，df=3，396，P＜0.001)、等效圆半径(F=382.473，df=3，396，P＜0.001)、偏心率(F=284.179，df=3，396，P＜0.001)、紧凑度(F=893.386，df=3，396，P＜0.001)、球状性(F=102.983，df=3，396，P＜0.001)、叶状性(F=44.338，df=3，396，P＜0.001)、圆形度(F=769.051，df=3，396，P＜0.001)。

其中，梨冠网蝽和女贞高颈网蝽分别在面积(2.74 mm2±0.21 mm2和2.72 mm2±0.23 mm2)、短轴长度(1.77 mm±0.09 mm和1.76 mm±0.30 mm)和等效圆半径(0.93 mm±0.04 mm和0.93 mm±0.04 mm)3个参数上显著高于其他2种网蝽，而悬铃木方翅网蝽(0.31±0.07) 和梨冠网蝽(0.32±0.04) 的球状性显著高于其他2种网蝽。其余参数在4种网蝽中均只有一个最大值，分别为梨冠网蝽的周长(20.92 mm±1.70 mm)和圆形度(0.39±0.02)，女贞高颈网蝽的长轴长度(3.91 mm±0.17 mm)和偏心率(0.58±0.05)，悬铃木方翅网蝽的紧凑度(0.28±0.05) 和叶状性(0.35±0.08)(图 1)。

独立样本t检测的结果表明，不同网蝽雌雄成虫在几何形态上均表现出一定的差异。但不同的网蝽雌雄成虫的差异在各参数间有所不同。其中，悬铃木方翅网蝽雌雄虫体在面积(t=9.045，df=98，P＜0.001)、长轴长度(t=3.195，df=98，P=0.002)、短轴长度(t=7.333，df=98，P＜0.001)、等效圆半径(t=8.995，df=98，P＜0.001)、偏心率(t=-19.955，df=98，P＜0.001)、球状性(t=-2.750，df=98，P=0.008)、叶状性(t=-3.769，df=98，P＜0.001) 和圆形度(t=8.840，df=98，P＜0.001) 等参数上的差异均有高度统计学意义，可以作为区别雌雄个体的几何形态学参数。而周长(t=1.911，df=98，P=0.059) 和紧凑度(t=0.896，df=98，P=0.372)2个参数在雌雄间差异无统计学意义(图 2：A)。

菊方翅网蝽雌雄成虫在面积(t=2.708，df=98，P=0.008)、等效圆半径(t=2.754，df=98，P=0.007)、偏心率(t=-6.609，df=98，P＜0.001)、紧凑度(t=2.944，df=98，P=0.004)、球状性(t=7.476，df=98，P＜0.001)、叶状性(t=6.829，df=98，P＜0.001) 和圆形度(t=4.219，df=98，P＜0.001) 等参数的差异有高度统计学意义，而周长(t=-1.036，df=98，P=0.303)、长轴长度(t=0.259，df=98，P=0.796) 和短轴长度(t=0.239，df=98，P=0.811) 的差异无统计学意义(图 2：B)。

梨冠网蝽雌雄成虫在面积(t=5.544，df=98，P＜0.001)、短轴长度(t=6.104，df=98，P＜0.001)、等效圆半径(t=5.525，df=98，P＜0.001)、偏心率(t=-5.685，df=98，P＜0.001)、球状性(t=5.508，df=98，P＜0.001)、叶状性(t=2.663，df=98，P=0.009) 和圆形度(t=5.938，df=98，P＜0.001) 等参数的差异均有高度统计学意义，周长(t=2.106，df=98，P=0.038) 的差异有统计学意义，而长轴长度(t=0.981，df=98，P=0.329) 和紧凑度(t=-0.025，df=98，P=0.980) 的差异无统计学意义(图 2：C)。

女贞高颈网蝽雌雄成虫在面积(t=9.699，df=98，P＜0.001)、等效圆半径(t=9.700，df=98，P＜0.001)、偏心率(t=-3.597，df=98，P=0.001)、球状性(t=6.250，df=98，P＜0.001) 和圆形度(t=6.518，df=98，P＜0.001) 等参数的差异有高度统计学意义，而在周长(t=0.534，df=98，P=0.594)、长轴长度(t=0.671，df=98，P=0.504)、短轴长度(t=0.597，df=98，P=0.552)、紧凑度(t=1.113，df=98，P=0.268) 和叶状性(t=1.375，df=98，P=0.172) 等参数的差异无统计学意义(图 2：D)。

通过比较4种网蝽雌雄成虫10个参数的差异，可以发现面积、等效圆半径、偏心率、球状性和圆形度5个参数在4种网蝽雌雄成虫间的差异均有高度统计学意义，初步认为这5个参数在区别不同网蝽成虫的性别时较稳定。而虫体的周长、长轴长度、紧凑度、短轴长度和叶状性在1种以上的网蝽中不能区别雌雄。

通过对4种网蝽10个参数进行判别分析，建立了3个典则判别函数(canonical discriminant function)：y1=7.892x1-0.332x2+10.913x3+6.762x4-67.930x5-0.487x6-8.533x7-27.909x8+26.193x9+ 22.965x10-4.867，y2=-12.077x1+0.055x2-2.489x3+0.683x4+75.098x5-5.898x6+38.403x7-0.933x8+1.554x9-27.975x10-24.112和y3=0.705x1+0.043x2+2.053x3-2.210x4+10.338x5-5.232x6+1.731x7+10.788x8-5.833x9+11.601x10-16.904，其贡献率分别为66.0%、26.4%和7.6%，其中前2个判别函数累积贡献率达到了92.4%。通过4种网蝽对应的Fisher线性判别函数，可以把绝大多数样本归于相应的组中。散点图(图 3)表明，女贞高颈网蝽与其他3种网蝽距离远，而梨冠网蝽和菊方翅网蝽较接近。判别分析结果进一步证明，4种网蝽的原始判别正确率为98.8%。有1头悬铃木方翅网蝽被误判为梨冠网蝽，3头菊方翅网蝽被误判为梨冠网蝽，1头梨冠网蝽被误判为菊方翅网蝽，而女贞高颈网蝽未出现错判现象。交叉判别的正确率为98.5%，其中有4头菊方翅网蝽被误判为梨冠网蝽，其他种类的判别结果与原始判别相同(表 1)。

4种网蝽2个性别作为8个处理，建立典则判别函数，其中前3个判别函数分别为：y1=6.309x1-0.327x2+11.390x3+7.590x4-66.899x5+2.741x6-10.835x7-30.797x8+28.008x9+28.589x10-7.655，y2=-14.552x1+0.017x2+0.985x3-1.184x4+89.056x5-15.524x6+36.906x7+5.774x8-3.250x9-20.272x10-35.627，y3=-11.501x1+0.025x2-3.304x3+4.061x4+42.901x5+12.173x6+9.640x7-14.436x8+10.219x9-11.142x10-8.986，其贡献率分别为57.4%、26.8%和13.7%，积累贡献率达到97.9%。通过对应的Fisher线性判别函数，可以把4种网蝽不同性别的样本归于相应的组中。由散点图(图 4)可以看出，菊方翅网蝽和悬铃木方翅网蝽不同性别间的距离较远，而梨冠网蝽和女贞高颈网蝽不同性别间的距离较近。判别分析结果证明，原始判别的正确率为86.5%。悬铃木方翅网蝽中，有2头雌成虫被误判为雄成虫，3头雄成虫被误判为雌成虫，且有1头雄成虫误判为雄性梨冠网蝽。而在菊方翅网蝽中，有5头雌性被误判为雄性，3头雌性被误判为雄性梨冠网蝽。有1头雄性梨冠网蝽被误判为雌性菊方翅网蝽，梨冠网蝽雌雄成虫均有12头被相互误判。女贞高颈网蝽没有出现种类误判，但雌雄之间有误判现象，有8头雌性和5头雄性被误判。交叉判别的正确率为85.0%，与原始判别结果相比，主要表现在菊方翅网蝽雌雄相互误判、雌性女贞高颈网蝽误判、雄性梨冠网蝽的误判以及其种类误判的差异上(表 2)。

本文对4种网蝽不同性别各平均值进行分层聚类分析(hierarchical clustering)，并分别采用组间平均距离(between groups linkage)、离差平方和法(Ward's method)、最短距离(nearest neighbor)、最长距离(furthest neighbor)和重心法(centroid clustering)等方法，类间距离的计算方法采用欧氏距离的平方(squared euclidean distance)。数据在进行标准化变换时，把数据范围变换为0~1。

分层聚类结果表明，当数据未经标准化处理并采用组间平均距离进行聚类时，女贞高颈网蝽雌雄和菊方翅网蝽雌雄先聚为一类，梨冠网蝽与其关系较近，而悬铃木高颈网蝽与三者关系较远。当标准化后，使用不同的聚类算法得到的结果有一定差异。其中，离差平方和法与最长距离算法得到的结果较近，属于方翅网蝽属的2种昆虫优先聚为一类，而不在同一属的梨冠网蝽和女贞高颈网蝽与其关系较远。利用重心法时，同一属的2种网蝽优先聚为一类，而在形态学上较相近的梨冠网蝽也与其聚为一类。相反，由于女贞高颈网蝽外部形态结构与上述3种网蝽相差较大，最后才单独与之聚类。而最短距离和标准化后的组间平均距离的聚类结果较接近，这2种方法都没有把传统分类学中同一属的2种网蝽优先聚为一类，而是梨冠网蝽和菊方翅网蝽优先聚类(图 5)。因此，本研究初步认为，对4种网蝽进行聚类分析，重心法得到的结果比较符合目前传统昆虫分类学研究的结果。

在1 200 dpi的分辨率下，利用BugShape 1.0提取到的10个参数在4种网蝽成虫中的差异均有高度统计学意义。其中，梨冠网蝽和女贞高颈网蝽成虫在面积、短轴长度和等效圆半径方面显著大于其他2种网蝽，悬铃木方翅网蝽和梨冠网蝽在球状性上大于另外2种网蝽。而其余参数大小在各种网蝽中表现不同，其中参数最大值为梨冠网蝽周长和圆形度、女贞高颈网蝽长轴长度和偏心率、悬铃木方翅网蝽紧凑度和叶状性。初步证实了这些参数可以用于区分研究中的4种网蝽成虫。

不同网蝽雌雄成虫在几何形态学参数上均表现出一定的差异，但各参数间的差异显著性不同。本研究初步认为，面积、等效圆半径、偏心率、球状性和圆形度5个参数在4种网蝽雌雄间的差异均有高度统计学意义，初步认为可以区分同种网蝽不同性别的个体。而其他参数在不同种网蝽雌雄成虫比较时，差异显著性不同，只能作为某一种网蝽雌雄成虫区别的参考指标。体型较大的昆虫可以手动测量体长、体宽等实际参数，但体型微小的昆虫，手动测量此类参数有一定的困难。本研究的结果认为，即使利用非典型形态特征(软件提取到的参数)，也可以有效地区分研究中的4种网蝽，且对不同性别的个体判别率较高，这为此类昆虫的自动鉴定技术提供了简单有效的数据获取方法。

4种网蝽判别分析结果表明，原始判别的正确率为98.8%，1头悬铃木方翅网蝽被误判为梨冠网蝽，3头菊方翅网蝽被误判为梨冠网蝽，1头梨冠网蝽被误判为菊方翅网蝽。交叉判别时的正确率为98.5%，其中有4头菊方翅网蝽被误判为梨冠网蝽，女贞高颈网蝽不存在误判现象。当4种网蝽和不同性别共同参与判别分析时，原始判别的正确率为86.5%，交叉判别正确率为85.0%。

数据通过标准化转换后，利用重心法得到的聚类分析结果比较符合传统昆虫分类学的结果。同一属的2种网蝽优先聚为一类，而在形态学上与其较接近的梨冠网蝽再与之聚为一类，最后女贞高颈网蝽单独与之聚类。相关的报道也显示，在聚类分析前均需要对数据进行标准化处理(张荣娇等，2016)。因此，利用该技术对此类昆虫进行聚类分析时，推荐使用数据标准化重心法。

本研究在进行图像获取时，未对4种网蝽的足进行标准化整理，可能会导致每种网蝽轮廓测量值与实际值产生一定的误差，对种类或性别的判别产生影响。与同类型文献报道(Li et al., 2017)相比，本研究采用的方法不对标本造成破坏，数据的获取受人为因素的影响小。此外，本文仅利用了网蝽整体形态学特征进行研究，选用的面积参数为虫体图像二值化后的图像像素总和，周长是二值化后虫体边缘像素积累值(于新文等，2003)，短轴长度和长轴长度是图像而不是虫体实际的长度和宽度。这些特征参数与昆虫实际的虫体面积、周长、体长和体宽等不是一个概念，需要加以注意。