自1979年首次发表以来，Western Blot（WB）实验一直是测定复杂生物样品中蛋白质相对表达的一项关键技术。随着实验技术的发展和技术的进步，文章发表越来越注重标准化和数据的可重复性。归一化是WB实验中重要的内部控制过程，通过简单的数学运算，降低泳道之间和样品之间难以避免的上样差异。通常WB实验的内参为不受实验影响的内源性蛋白。将内参蛋白作为上样浓度的指标。

大部分WB实验都使用管家蛋白（Housekeeping proteins）作为内参蛋白，通常使用的管家蛋白为：肌动蛋白（如：β-actin），微管蛋白（如：α-tubulin），3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）。通常，这些管家蛋白在细胞和组织中高度表达，但是管家蛋白在实验中也经常受到病理条件和实验条件的影响。例如，细胞汇合度（Cell Confluence），上样蛋白总量和细胞/组织类型都有可能影响看家蛋白的表达水平。例如，NIH3T3成纤维细胞中细胞汇合度从10%增加到100%的过程中（细胞瓶长满的过程），α-tubulin和GAPDH表达明显增加。WB实验在较大的总蛋白量上样量条件下，β-actin的一抗会无法检测蛋白含量变化。不同的研究如果使用的看家蛋白不一致，很难进行相互之间的比较，数据分析和解释也会不准确。如果研究人员希望使用看家蛋白作为归一化方式，还需要验证这个看家蛋白不受实验条件的影响。因此一种不受实验条件影响的，统一的归一化方法显得非常有必要。

总蛋白归一化（Total protein normalization）是目前最可靠的WB实验蛋白归一化方法。总蛋白归一化在灵敏度，可重复性方面均优于看家蛋白实验方式，研究者需要荧光成像系统和荧光染料标记的二抗，就可以进行总蛋白归一化精确定量上样蛋白。一般来说，总蛋白归一化适合高表达量和低表达量的目的蛋白检测，常见的看家蛋白仅仅适合高表达量的目的蛋白检测。如果一定要使用看家蛋白进行WB实验，现在的期刊要求研究者：1）测定看家蛋白和目的蛋白的线性范围，2）在不同的实验条件下证明看家蛋白不受到实验条件影响，3）补充信息验证一抗的特异性，或者建议至少使用两种看家蛋白，一种表达量高，一种表达量低，作为内参进行归一化。由于实验课题通常包含多个目的蛋白的检测，多次重复看家蛋白的标准曲线会增加相当大的工作量，因此使用蛋白归一化可以减少工作量，节约研究者宝贵的时间。

图1. 证实了β-actin和β-tubulin在病理组织中表达改变。 SMA脊髓提取物中检测肌动蛋白和微管蛋白。 A.绿色（42 kDa）的β-actin条带与总蛋白染色的凝胶（红色）重叠。 B.以总蛋白染色的凝胶（红色）覆盖绿色（60 kDa）的β-tubulin条带。 C.当比较SMA小鼠（SMA）与野生型对照（WT）时，β-actin（黑色条）和β-tubulin（灰色条）的表达水平的百分比变化的定量结果。 总蛋白染色（白条）用作对照。

很多文章将总蛋白归一化与常见的看家蛋白进行比较，证明了在定量WB实验中，相同的上样量条件下，常见的看家蛋白会在组织中差异表达。例如，在脊髓性肌萎缩症小鼠模型中，与健康野生小鼠相比，疾病组β-actin和β-tubulin在脊髓组织中的表达量都会减少，β-actin表达降低了19.3±2%，β-tubulin表达降低了7.3±0.5%。如果使用了β-actin作为WB实验的看家蛋白作为内参，WB的定量实验数据结果可能偏离了20%。看家蛋白作为上样内参（Loading control）的时候，线性范围非常窄，极大的限制了研究者的实验设计，难以满足WB实验的定量需求。

图3. 蛋白质稀释系列的定量显示β-actin（黑色圆圈）和β-tubulin（空心三角形）的线性范围。 β-tubulin的线性范围 3 logs）内呈线性，可实现可靠的定量灵活— AzureRed可与荧光标记的抗体以及化学发光检测系统一起使用

Azure Biosystems通过高性能的成像系统，分析软件和高灵敏试剂，提供一致的Western Blot实验流程。成像系统为您提供研究所需的灵活性，定量Western Blot解决方案帮助您更好的完成实验。

● 双激光近红外——近红外采用激光光源，激发强度大，单色性好，减少光泄露，图像信噪比高。

● 配置应用灵活——有不同型号可选择，全面升级，同时配合AzureRed和Total ProteinQ全蛋白染色试剂，可进行全蛋白定量，更符合杂志发表要求。

● 四通道荧光同时成像——可同时在一张印膜上检测4种蛋白，无需剥离和二次孵育。

● 高分辨率快速成像——9.1MP像素，2min完成深度制冷，无需等待，即插即用。

● 彩色图片成像——可进行彩色Marker与化学发光条带自动整合，分子量查看更加直观。

● 触屏电脑操控——13.3英寸尺寸触摸屏，界面更加友好，使用更方便。