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作者：

张浩

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摘要：

登革热(Dengue fever, DF)是由登革病毒(Dengue virus, DENV)感染引起的一种急性的媒介传染病,该病毒感染宿主后其临床表现各异,可以表现为无症状、轻型的流感样综合征,也可以表现为重症登革热(Severe dengue disease,SD),即登革出血热(Dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克综合症(Dengue shock symptom、DSS)。登革病毒是有包膜的单股正链RNA病毒,由11000个核苷酸组成。其基因组编码成一个多肽链后,在宿主的信号肽酶及病毒编码的蛋白酶作用下,裂解成三种结构蛋白(衣壳蛋白C、膜蛋白及其前体M/prM和包膜蛋白E)和7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。 DENV分为4种血清型:DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4。该病主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊传播,流行于热带及亚热带地区,尤其是在亚洲、太平洋群岛及中、南美洲国家已构成严重的威胁。据估计2010年感染登革病毒的人群约有3.9亿,其中显性感染为0.96亿,隐性感染达到2.94亿。目前,尚无有效的抗病毒药物和疫苗用于临床。同时伴随着世界社会和经济效益的影响,登革热传播地理范围逐渐增广、感染人数逐渐增加和疾病的负担逐渐加重,因此其已经成为严重的公共卫生问题之一。我国大陆自1978年广东省佛山市首次暴发登革热疫情以来,登革热在我国已经流行了37年。已经报道流行的地区有海南、广西、福建、浙江和云南省,2013年河南省也报道了登革热的暴发。2014年广东省暴发了自1986年以来最大的一次登革热疫情,共有44894例患者,死亡6例。四种血清型的登革热病毒在我国大陆都有流行过。1979年和1985年广东省流行的登革病毒为DENV-1,而且1991年和1995年至2014年登革热的流行和散发也是由DENV-1感染导致的；1985年海南省、1988年的广西省、1993年、1998年和2001年广东省、1999年福建省暴发的登革热是由DENV-2感染导致；1982年以来我国大陆就很少有DENV-3的流行,而DENV-4为散发病例,常伴随其他登革病毒的血清型共同流行。目前,最广为接受的登革热的基因分型使用的基因区域是E基因区域。虽然登革热在我国国大陆流行以来,有研究使用登革病毒E基因区域分析其分子和进化的特征,但是尚无研究评估登革病毒的各个基因区域是否适合用于登革病毒的分子流行病学特征的分析。所以需要分析我国大陆流行的登革病毒的分子流行病学特征,即评估登革病毒各个基因区域能否准确反应登革病毒全基因的特征和登革病毒的时空特点。感染登革病毒后,疾病谱较为宽广,可以是无症状,或是重症,甚至可能威胁生命。世界卫生组织登革热指南中确诊登革病毒感染的方法有:登革病毒的分离和鉴定、病毒核酸检测和血清中抗体检测(IgM/IgG)检测。但是这些方法都存在局限性,例如需要急性期患者的血清(感染登革病毒0-5天)、病毒的分离和确定需要较长时间(1周)、检测结果的假阳性和假阴性,以及血清学检测需要恢复期患者的血清进一步确诊。所以需要一种经济费用较低、省时和方便的实验室检测方法来确诊登革病毒的感染。自从使用酶联免疫吸附法(ELISA)检测到登革病毒的非结构蛋白1(NS1)后,学者们发现NS1蛋白有两个存在形式:膜性和可溶性,并且都是非常保守的。据报道无论是首次感染还是二次感染登革病毒,登革热患者在发病的急性期(O到6天)就能够检测到血清中的NSl蛋白,并且登革热发病后9-18天,仍能在患者的外周血中检测到。这为确诊登革热提供了较为广泛的时间窗口。目前主要有两种技术手段检测登革病毒的NSl蛋白:一种是酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent assay, ELISA),另外一种是免疫层析法(Immunochromatography assay, IA)。根据这两种技术原理,也开发出了相应的捕获登革病毒NS1蛋白商用试剂盒。在大多数的临床研究中,也表明这两种方法诊断登革热的敏感性和特异性较好,所以需要与传统实验室检测方法(登革病毒的分离和鉴定、病毒核酸检测和血清中抗体检测(IgM/IgG)检测)相比,系统性的评价这两种技术在确诊登革热中的作用。2009年世界卫生组织(WHO)将登革热分类为登革热和重症登革热,包括了一系列的"预警指征"旨在帮助临床医生预测有可能进展为重症登革热的患者。因为登革热患者预警指征帮助临床医生早期识别患者的疾病转归,并决定患者的管理和治疗。早期出现登革热轻型临床表现的患者可以通过传统的实验室检测病毒或特异性的抗体来确诊登革热病毒的感染,但是对于重症登革热患者难以确诊,因为其临床表现相对出现在疾病的晚期,常常是患者血液中已经检测不到病毒和特异性的抗体,也缺乏其他特异性的实验室检测指标。然而,由于有较好的临床支持治疗和护理,重症登革热的死亡率是可以不超过1%。因此,很多学者的研究集中到能确定患者疾病进展的高风险因素。WHO的指南将非重症登革热分为两类:一类是登革热伴有腹痛、粘膜出血和肝肿大等预警指征,另外一类是不伴有预警指征的登革热,而登革热伴有预警指征的患者提示需要重症监护、疾病更严重,甚至是与死亡相关,所以临床表现仍是早期预测的指标。虽然有报道登革热的其他的临床症状,如恶心、呕吐、腹痛、皮疹和出血等临床症状也与重症登革热有关,但是这些关系仍未阐明。临床上登革热患者出血的症状表现各异,例如皮肤瘀斑、束臂试验、牙龈出血、胃肠道出血等。原先诊断登革出血热的标准之一:束臂试验,也有研究已经表明不能区分登革热和登革热出血热。基于以上研究之间存在着争议,需要对既往研究进行系统的评价,确定早期预测重症登革热的临床症状和体征,以降低重症登革热的死亡率。血液学的参数也常常被认为是潜在的预测因子,最常用的指标是血小板计数。但是血小板减少症与出血的相关性不佳,只有一项研究中证实低血小板计数与血管渗漏的严重程度相关。登革热患者的肝脏损害也是常见症状之一,各种程度的感染都能导致转氨酶的升高。患者的肝脏损害越严重,疾病的临床表现就越严重。在疾病的极期,低蛋白血症与血管渗漏也存在很好的相关性。最新一项系统性评价结果表明凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血酶原时间(APTT)的延长与登革休克综合征是显著相关的。然而这些这些研究结果主要来自亚洲和拉丁美洲,缺少我国大陆的相关数据。2014年我国广东省出现了自1978年以来暴发规模较大的一次流行,截止到2014年12月1日,共有共有44894例登革热患者。所以需要研究我国登革热患者的数据,从临床症状、体征和血液学参数分析重症登革热的预测因素。第一部分我国大陆登革病毒全基因的时空分析研究方法从NCBI的GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下载我国大陆1978年至2011年登革病毒全长基因序列,并同时下载国际公认标准株序列,即:登革病毒Ⅰ型夏威夷株(DENV-1, Hawaii株)、登革病毒Ⅱ型新几内亚株(DENV-2, New guinea-C株)、登革病毒Ⅲ型H87株(DENV-3, H-87株)和登革病毒Ⅳ型H241株(DENV-4, H241株)。将DENV-1和DENV-2病毒的基因序列装载到Mega5.05软件中进行多序列比对,比对完成后构建系统进化树和基因的遗传进化距离。对四种血清型的氨基酸变异分析,使用统计软件SPSS13.0软件。计量资料采用均数±标准差(x±S)。对于符合参数检验的多组之间采用One-Way ANOVA(检验统计量:F),两组间采用Student-t Test(检验统计量:t)；对于不符合参数检验的多组之间采用非参数检验:Kruskal-Wallis检验(检验统计量:x2)、Mann-Whitney U检验(检验统计量:Z),取双侧P0.05为有统计学差异。研究结果1.共纳入分析登革病毒40株,其中DENV-1为19株,DENV-2为11株,DENV-3为6株,DENV-4为4株。DENV-1和DENV-2的14个基因区域与全基因构建的进化树不完全相似,并且各个基因的遗传进化距离变异较大。2.根据登革病毒的四种血清型分为四组:DENV-1氨基酸突变个数为85.211±13.252个；DENV-2为72.727±21.448个；DENV-3为59.167±22.649个；DENV-4为82±18.129个。统计分析结果显示四种血清型的登革病毒之间的氨基酸变异个数具有显著性统计学差异(F=5.661,p=0.003),进一步的多重比较选LSD法,DENV-1与DENV-2和DENV-3氨基酸变异数存在显著性差异(p=0.002和p=0.003),其余组之间无显著性差异,说明DENV-1的氨基酸变异个数最多。3.根据登革病毒的分离时间和血清型分为四组:1991年至2000年的DENV-1,共5株,开放阅读框的氨基酸变异个数82±6.7个；2001年至2010年的DENV-1,共12株,氨基酸变异个数为89.2±14.2个；1991年至2000年的DENV-2,共4株,氨基酸变异个数为74.8±7.8个；2001年至2010年的DENV-2,共4株,氨基酸变异个数为70.0±5.7个。统计分析结果显示四组之间的氨基酸变异个数具有显著性统计学差异(F=3.671,p=0.029)；进一步研究发现以2000年以后流行的DENV-1和DENV-2病毒株的E基因区域(非参数检验:Mann-Whitney U法)和NSl基因区域(参数检验:Students-t法)的氨基酸变异个数存在显著性统计学差异(E基因区域:Z=2.961,p=0.003; NS1基因区域:t=4.896,p0.001)。4.进一步分析发现在DENV-1病毒株的E基因区域出

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关键词：

登革病毒 登革热 基因 时空特点 预测 临床特点

学位级别：

博士

学位年度：

2015

DOI：

10.7666/d.Y2911266

被引量：

1