技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种实验研究用痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法。

背景技术

现有技术公开了痤疮丙酸杆菌是一种厌氧的革兰阳性杆菌，主要定植在皮肤毛囊皮脂腺单位，是人体皮肤的共生菌群。痤疮丙酸杆菌在痤疮的发生发展中有重要的作用，此外，其也可作为一种机会致病菌，引起多种植入物相关感染。目前，系统或局部抗生素被广泛用于治疗痤疮丙酸杆菌引起的感染，然而，痤疮丙酸杆菌对抗生素的耐药率正在不断升高；据研究报道，目前其对抗生素的耐药率已高达55.5%，其中尤以对大环内酯类和林可霉素类抗生素的耐药率最高。近年来，关于细菌生物膜形成导致抗生素耐药的研究越来越多。

细菌生物膜是细菌在生长过程中为适应生存环境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一种与浮游细胞相对应的生存方式，有三个关键的组成部分：细菌细胞、供细菌附着的平面，以及细胞外的多糖蛋白复合物；后者由细菌分泌，并能够保护细菌免受宿主免疫反应及局部和系统抗生素治疗的伤害。由于痤疮丙酸杆菌生长缓慢，临床怀疑是痤疮丙酸杆菌引起的严重或深部感染，需延长厌氧培养至14天，且生长所需环境条件严格（微需氧或厌氧），故体外构建其生物膜的难度较大，按照常规生物膜构建方案难以很好地形成的生物膜。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提出一种实验研究用痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷或不足，提供一种实验研究用痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法，所述构建培养方法能有效解决现有技术对体外构建痤疮丙酸杆菌生物膜不理想的问题。

本发明的实验研究用痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1 称备原料：BHI 干粉、酵母提取物；

步骤2 配置培养基：将BHI干粉、酵母提取物溶于水中，再加入葡萄糖配制成1%葡萄糖溶液，混合搅拌均匀，制得BHI Sup.培养基，调整培养基pH值为7.0；

步骤3 复苏种菌：将冻存的痤疮丙酸杆菌菌株于室温下融化后在血平板上划线种菌，待细菌复苏后接种于布氏琼脂肉汤，调整菌株的OD600nm，使用振荡培养箱在厌氧培养；

步骤4 重悬菌体：使用无菌离心管收集培养菌体，离心处理后，弃上层清液，使用布氏琼脂肉汤重悬菌体，调整OD600nm值至1.0；

步骤5 菌种培养：将重悬后的菌体用BHI Sup.培养基稀释，然后加入96孔板，厌氧培养。

本发明步骤1中，称得37g的BHI 干粉、5g的酵母提取物；

本发明步骤2中：将37g BHI干粉、5g酵母提取物溶于1L水中，再加入葡萄糖配制成1%葡萄糖溶液，搅拌均匀，制得BHI Sup.培养基，调整培养基pH值为7.0；

本发明步骤3 中：细菌复苏后接种于布氏琼脂肉汤，菌株的OD600nm均调整为0.1，振荡转速为220rpm， 37℃厌氧培养120h；

本发明步骤4 中：培养的菌体用离心机处理，离心转速6000rpm，时间5min，所述的重悬菌体调整OD600nm值至1.0；

本发明步骤5 中：将重悬后的菌体以1:100比例用BHI Sup.培养基稀释，加入的96孔板为200ul／孔，37℃厌氧培养120h。

本发明所述构建培养方法中，冻存的痤疮丙酸杆菌的菌种取自痤疮患者皮损处，经分离鉴定后获得，保证痤疮丙酸杆菌的纯净；

本发明所述构建培养方法中，所述取得的菌种放置在甘油中，于-80℃中保存；

本发明所述构建培养方法中，所述水为去离子水；

本发明所述构建培养方法中，所述血平板采用哥伦比亚血琼脂平板；

本发明所述构建培养方法中，所述复苏后菌种接种于布氏琼脂肉汤；

本发明所述构建培养方法中，所属重悬所用培养基为布氏琼脂肉汤；

所述步骤2和步骤5中，培养温度均为温度37℃；

所述步骤2和步骤5中，培养环境均为厌氧环境；

所述步骤5中，菌种培养为在96孔细胞培养板上进行培养；

本发明所述构建培养方法中，所述酵母提取物采用高纯度高蛋白型酵母提取物。

本发明的有益效果是：

（1）通过配置的BHI Sup.培养基，并在厌氧环境下进行痤疮丙酸杆菌培养，解决了由于痤疮丙酸杆菌生长条件严苛（厌氧或微需氧）、且生长速率慢、及采用现有技术在体外构建其生物膜较为困难的问题。

（2）本发明中，所述BHI Sup.培养基价格低廉、容易配制，采用其构建的痤疮丙酸杆菌生物膜生物量、生物膜内活菌数量、生物膜结构均优于现有常规培养基，是研究痤疮丙酸杆菌生物膜的理想培养基，为后续研究痤疮丙酸杆菌生物膜及其在抗生素耐药中的作用奠定了基础。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

具体实施方式

实施例1

一种实验研究用痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法，包括以下步骤；

步骤1：称备原料，称得30g的BHI干粉、5g的酵母提取物、由葡萄糖配置成的1%葡萄糖溶液和1L的去离子水；

步骤2：配置培养基，将酵母提取物与去离子水混合，同时加入37g的BHI干粉，混合搅拌均匀，制得BHI Sup.培养基，培养基pH值为7.0；

步骤3：复苏种菌，将冻存的痤疮丙酸杆菌菌株于室温下融化后在哥伦比亚血琼脂平板上划线种菌，待细菌复苏后接种于布氏琼脂肉汤，菌株的OD600nm均调整为0.1，使用振荡培养箱在温度37℃，转速220rpm环境下振荡厌氧培养120h；

步骤4：重悬菌体，使用无菌离心管收集培养出的菌体，采用离心机处理，离心转速6000rpm，时间5min，抽离上层清液不用，然后使用布氏琼脂肉汤重悬菌体，调整OD600nm值至1.0；

步骤5：菌种培养，将重悬后的菌体以1:100比例使用BHI Sup.培养基进行稀释，然后加入96孔细胞培养板（200ul／孔），在37℃厌氧环境下培养120h。

实施例2

一种实验研究用痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法，本实施例在上述实施例1中，进一步提出痤疮丙酸杆菌生物膜的半定量检测方法，包括以下步骤：

步骤1：在使用96孔细胞培养板体外培养痤疮丙酸杆菌至第96h和120h时，分别进行如下操作：弃用菌液，加入PBS洗去未粘附细菌，重复洗3次；

步骤2：向已使用PBS洗去未粘附细菌的96孔细胞培养板加入99%甲醇固定15min，弃去液体后室温环境下干燥；

步骤3：再向96孔细胞培养板加入1%结晶紫染色8min，自来水冲洗至流水无色，室温干燥；

步骤4：再向96孔细胞培养板加入10%乙酸溶液溶解生物膜，室温干燥后使用分光光度仪测定OD570nm。

实施例3

一种实验研究用痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法，本实施例在上述实施例1中，进一步提出痤疮丙酸杆菌生物膜内活菌数量的检测方法，包括以下步骤：

步骤1：在使用96孔细胞培养板进行培养第96h和120h时，分别进行如下操作：弃用菌液，加入PBS洗去未粘附细菌，重复洗3次；

步骤2：向96孔细胞培养板上的每个孔加入100ul 生理盐水，反复吹打使生物膜内细菌完全重悬于生理盐水中；

步骤4：将每孔内重悬后的菌液分别转移至白色96孔酶标板内，并向每孔加入20ulCellTiter-BlueTM试剂，使用混均仪300rpm摇1min，37 ℃厌氧环境下培养1h，并使用酶标仪记录Em560/Ex590nm荧光；

实施例4

一种实验研究用痤疮丙酸杆菌生物膜的构建培养方法，并提出痤疮丙酸杆菌生物膜形态结构的观察方法，包括步骤：

步骤1：称备原料，称得BHI干粉37g ，5g酵母提取物，去离子水1L；

步骤2：制备培养基，将酵母提取物、BHI 干粉与去离子水混合，再加入葡萄糖配制成1%葡萄糖溶液，混合搅拌均匀，制得BHI Sup.培养基，调整培养基pH值为7.0；

步骤3：复苏种菌，将冻存的痤疮丙酸杆菌菌株于室温下融化后在哥伦比亚血琼脂平板上划线种菌，待细菌复苏后接种于布氏琼脂肉汤，菌株的OD600nm均调整为0.1，使用振荡培养箱在温度37℃，转速220rpm环境下振荡厌氧培养120h；

步骤4：重悬菌体，使用无菌离心管收集培养出的菌体，采用离心机处理，离心转速6000rpm，时间5min，吸弃上层清液不用，然用使用布氏琼脂肉汤重悬菌体，调整OD600nm值至1.0；

步骤5：菌种培养，使用BHI Sup.培养基以1:10比例进行稀释，然后加入fluorodish（2ml／dish），37℃厌氧环境下培养120h。

步骤6：弃上清，生理盐水轻柔洗3次，加入600ul Live/Dead染液，室温放置20min后于激光共聚焦显微镜下观察。。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。