2017年，中国药监部门加入ICH（国际人用药品注册技术要求协调会），并于2018年当选为ICH管委会成员，中国药品注册管理制度加速与国际接轨。其中ICHQ5A是针对于生物制品病毒安全性评价最为重要的国际性指导原则。 今年10月， ICHQ5A时隔23年迎来了新的改版草稿的发布。针对连续流生产工艺的病毒安全性及病毒清除相关的考虑要点做出了明确的阐述。 新的技术为生物安全性检测提供了新的方案和思路，鉴于NGS的多方面优势，新版指南中新增了关于NGS技术用于病毒安全性检测的大段陈述，为业界应用NGS技术提供了指导。

ICHQ5A（R2）涵盖产品范围

ICHQ5A（R1）中载明：文件的范围涉及从特定细胞库开始的细胞培养物中所提取的产品，既包括从体外细胞培养物所提取的产品，如干扰素、单克隆抗体和重组DNA产品（包括重组亚单位疫苗），也包括从体内如腹水内培养的杂交瘤（hybridoma）细胞中提取的产品。在ICHQ5A（R2）中涵盖了更多的产品类型：除了R1中的产品之外， 该文件还适用于某些基因工程病毒载体和病毒载体衍生产品。

生物制品（包括基因治疗产品）的病毒来源于哪?

外源性病毒污染源

物料（表达载体构建和生产制造过程中，可能使用的动物来源或动物来源成分的物料，如牛血清、胰蛋白酶等；可能被病毒污染的化学培养基等）；人员自身或未按规程操作；设施环境（密封问题、设备清洁问题，交叉污染等）

内源性病毒污染源

生产用工程细胞和细菌，本身可能使用了病毒载体或者细胞本身内源性的病毒样颗粒；组织或体液等

对于基因治疗产品，用于生产的辅助病毒被认为是与工艺相关的病毒污染物。

ICHQ5A R2中对于细胞库病毒安全性检测的推荐

NGS方法被推荐在适当情况下替代针对于细胞库的体内检测和体外检测法。

NGS技术已在多种项目中得到证实并发表。 最突出的发现是在商业化疫苗中发现了猪圆环病毒污染，以及在重组表达或病毒载体生产中使用的 SF9生产细胞系中检测到一种昆虫病毒。这些结果的重要性在于之前所有检测方法都无法检测出病毒污染物。

在R2中提到，下一代测序（NGS）和核酸扩增技术（NAT）（如聚合酶链反应（PCR））可分别适用于广泛和特异性病毒检测。这些试验的引入可以在不与当前推荐的体外和体内试验进行系统的头对头比较的情况下进行。特别是，不建议在体内试验中进行头对头比较，以满足替代、移除和改进(replace, remove, refine)动物使用3R原则的全球目标。由于检测灵敏度和病毒检测的广度，NGS也可用于替代基于细胞的感染性检测，以克服潜在的检测限制，或检测检测系统中没有可见表型的病毒。阳性结果，应经过调查以确定检测到的核酸是否与感染性病毒有关。

在ICHQ5A（R2）草稿3.2.5.2中专门针对NGS方法进行了说明。具体如下：新的先进分子方法如NGS（也称为高通量测序）可用于广泛的病毒检测。 NGS可以提供确定的病毒检测灵敏度和广度，并可以减少动物使用和测试时间。对于使用的任何NGS方法，应提供验证包以支持其在应用中的使用。这包括方法验证和分析方法确认或基质特异性的确认（视情况而定）。基于潜在的安全问题，生物信息学分析可以针对特定病毒，也可以针对未知病毒检测。NGS可以用广谱病毒检测来替代体内实验，以检测未知或未曾预见的病毒种类。NGS还可以补充或替代体外细胞培养试验，以检测已知和未知或未曾预见的病毒种类。此外，该测定也可用于检测已知病毒，并且它可替代HAP、MAP和RAP试验以及其他病毒特异性PCR测定。

NGS 的使用可在以下情形下被特别考虑：检测或表征细胞基质或细胞库中已知和未知病毒，病毒种子或者病毒收获液中由于没有有效的中和载体病毒措施而对检测产生干扰时，或者产品本身毒性或培养基组分存在毒性时。在此类应用中，NGS可用于检测细胞DNA中存在的病毒序列（基因组学）或细胞中的RNA（转录组学），或可用于检测病毒颗粒中存在的病毒基因组（病毒组学），并应提供选择这些不同策略的理由。

当应用NGS检测已知病毒和/或广谱检测新病毒时，申请人应考虑NGS工作流程中的几个关键步骤。这些包括1）样品处理（当进行时）和基于样品材料类型的处理，2）有效的病毒核酸提取（包括包膜和非包膜颗粒）和文库制备，3）选择合适的测序平台，以及4）针对具有不同病毒家族的病毒序列的不同表示的数据库进行全面的生物信息学分析。

应使用合适的标准品或参考材料进行方法确认和验证，以评估方法中涉及的不同步骤的性能，并证明病毒检测的敏感性、特异性和广度。这可以包括使用当前可用的具有不同物理（大小、包膜和非包膜）、化学（低、中和高抗性）和基因组（DNA、RNA、双链和单链、线性、环状）特征的参考病毒试剂来评估整个NGS工作流程或特定步骤的性能；一个全面病毒数据库应该用于多种序列的广谱病毒检测。此外，其他标准类型可用于评估特定的技术和生物信息学步骤。由于NGS具有复杂的工作流程，鼓励制造商与适当的监管机构就方法验证和数据提交的期望进行讨论。

ICHQ5A R2 Table 1. Virus Tests Recommended to Be Performed Once at Various Cell Levels （建议在不同细胞水平进行一次病毒检测）

a. 应按上表所述对每个WCB进行外源病毒测试。适当时，如果在MCB上进行了外源病毒检测，并且培养至LIVCA或LIVCA以上的细胞来自WCB并用于检测外源病毒的存在，则可省略对初始WCB的类似检测。通常不建议WCB进行抗体产生实验。在每个WCB上而不是在MCB上进行完整检测的替代方案也是可以接受的。

b. 限定代次细胞：用于生产的达到培养限定代次的细胞（Cells at the Limit of In Vitro Cell Age Used for Production）

c. 也可能检测到其他病毒

d. 如果已知一种细胞系组成性地产生逆转录病毒颗粒，则可能不需要该检测

e. 适用于已知已被此类病毒感染过的细胞系

f. 体外病毒检测直接在WCB或直接源自该WCB的LIVCA细胞上进行。基于风险评估，使用NGS进行病毒检测可以用作体外检测（细胞培养法和PCR法）的补充或替代检测

g. 可根据风险评估进行体内法检测。然而，体内实验对于表征良好的细胞系是非必须的，如CHO、NS0和SP2/0，具体需要根据细胞系历史，先验知识以及其他基于风险的考虑。这包括原始（亲本）未转染细胞系的体内病毒试验或NGS试验以及从原始细胞库衍生MCB的控制。还应考虑对来自同一原始细胞库的其他MCB进行病毒安全性测试的先验知识，包括用于建立MCB的方法。如果第一个WCB或后续WCB是在批准的受控条件下准备的，则通常不需要进行测试。对于LIVCA的细胞，基于先前的知识和其他基于风险的考虑，可能不需要进行测试。如果残留风险仍然存在，可以考虑保留体内检测或用检测广泛病毒的分子生物学方法（如NGS或PCR）替换，以检测可能在MCB建立期间或LIVCA阶段细胞培养期间引入的病毒。

h. 例如MAP、RAP、HAP，其通常适用于啮齿动物细胞系。病毒特异性PCR或靶向分子方法可以用作动物试验的替代

i. 例如基于细胞系的起源和历史，包括相关的原材料和试剂

j. 适用时，应考虑使用NGS替代体内试验，并可根据试验适用性和风险评估，用于补充或替代体外试验和其他病毒特异性试验

指南中除了上述针对于细胞株病毒检测的描述，针对于上清收获液（UPB），也提到应对每一批UPB进行定期病毒检测。这可能包括使用几种细胞系体外筛选实验或广谱病毒检测分子方法（如NGS）。

法规中对于NGS检测方法的陈述在此前欧洲药典 EP 5.2.4也有涉及，其中指出对于疫苗产品的质控可用体外方法替代体内方法。

NGS检测及其优点

1. 无需预先知晓病毒序列信息：NGS与PCR不同，NGS不需要事先知道病毒序列信息，因此可以在病毒未知的情况下进行检测。

3. 减少动物使用：替代体内方法

4. 检测周期相对较短：比体内方法周期短，周转时间可在２周左右

5. 方便用于病毒种子或者病毒载体类产品：无需制备中和抗体

Charles River NGS检测服务

（具备GMP证书）

在生物制品的安全性检测中，Charles River在生物制品领域有50多年深入实践和长期经验，拥有法规专业知识、专有病毒数据库及资深病毒学和生物信息学专家。 Charles River高效一体化且灵活的NGS方案优势还在于拥有GMP和GLP认证的实验室，符合法规要求，能够快速有效地进行生物制品安全性检测和QC检测，可检测原材料，MCB、WCB、病毒种子库等。

Charles River的NGS技术能够为客户提供符合GMP或GLP标准的检测，以满足不同地区监管要求，为产品安全性提供高质量服务，以此加速生物药上市进程。

总结

技术的进步推动了行业的发展，NGS在R2中的引入也说明监管机构对于新技术和认可。

尤其在细胞与基因治疗越来越火热的背景下，由于这些新型疗法工艺步骤中能够有效清除病毒的步骤相比于传统的单抗类药物十分有限，因此病毒检测范围广且高度灵敏的技术对生物制品的安全性显得尤为重要。随着对病毒不断深入的了解，病毒检测技术的不断进步，病毒的安全在逐步提高。而 Charles River NGS技术在符合法规趋势的同时，也将成为对生物制剂病毒安全风险策略的重要工具。

关于Charles River细胞库检定服务

Charles River 成立于1947年，目前在全球拥有110+生产/实验设施。2021年，支持86%的FDA上市新药的研究和/或开发。

Charles River 生物制品服务部门在全球多个实验室提供GMP细胞株完整检定服务，驾玉生物是CRL在中国的合作伙伴。Charler River在细胞检定领域拥有50+年经验，提供包括鉴别检测、无菌、支原体、分枝杆菌检测、外源病毒体内体外方法检测、逆转录病毒检测、种属特异性外源病毒因子检查、猪、牛源性病毒检查、遗传稳定性检测等，可对动物细胞（包括不限于CHO，HEK293, Hela, Vero）、细菌(如E.coli)、酵母（如S．cerevisiae）的MCB、WCB、EOPC、UPB进行检定，也针对病毒库（MVB、WVB、EOPC）进行检定，提供针对细胞基因治疗的RCV(RCL, RCR，RCAAV)检测，并提供特色的GMP级别的NGS外源病毒检测服务，满足客户的海外IND及BLA申报需求。返回搜狐，查看更多