抗原呈递细胞（APC）源外体的膜组分中包括了主要组织相容性复合体（MHC-I和 MHC-II）、诱导性共刺激分子 B7 等。因此，当 APC 经抗原致敏后，其分泌的外体同样携带了抗原肽-MHC 复合体，可直接供给相应的 CD4+T 和 CD8+ T 淋巴细胞识别。并且，这些外体可被巨噬细胞、树突状细胞等 APC 本身摄取而发生交叉抗原呈递[16]。目前，有多种方法可制备装载抗原的APC源外体。例如，从病原感染动物的骨髓、外周血或脾脏分离APC进行体外培养，从培养液中分离与纯化外体；也可从动物体内分离APC后在体外培养的条件下，用病原感染或抗原致敏细胞再从培养液中分离得到外体。

为了探究装载病毒蛋白的外体功能，需要分离纯化得到无病毒颗粒残留的外体。由于病毒的粒径大小范围与外体接近，因此采用上述2种方法均需通过免疫磁珠法分离外体去除残留的病毒。然而免疫磁珠法分离提取外体产量低且成本高昂，但缺少适用于家禽细胞外体提取的商品化免疫磁珠方法。有数据证实在病毒感染细胞分泌的外体中能检测到病毒蛋白或病毒粒子。例如，禽白血病病毒ALV-J亚型感染的细胞分泌的外体中可检测到病毒gag和env蛋白[17]，从而促进病毒介导的免疫抑制，或者在禽网状内皮增生病毒感染的精子分泌的外体中也可检测到病毒蛋白的存在[18]；在新型冠状病毒感染的宿主体液循环中的外体中也可检测到SARS-CoV-2的S蛋白表达[19]，而IBV与SARS同属冠状病毒科，病毒组成与结构相似。据此笔者推测，在细胞中表达的IBV病毒S蛋白也可被装载入外体中。本研究选择采用慢病毒过表达系统以达到在抗原呈递细胞系HD11中表达IBV病毒S1蛋白的目的，由于慢病毒包装系统所产生的假病毒属于复制缺陷型病毒，重组慢病毒仅保留感染细胞以及在细胞中表达携带外源基因的能力，但不会在宿主细胞中复制，所以，采用该方法可避免在外体提取过程中混入病毒，同时满足模拟病毒感染抗原呈递细胞以及实现病毒蛋白在细胞中的表达。

巨噬细胞通过吞噬作用清除其环境中的病原体，在先天性和适应性免疫反应中发挥重要的功能，而巨噬细胞中的蛋白酶体是巨噬细胞完成内源性抗原呈递和调控下游免疫应答和炎症反应的重要部分[20]。在本研究构建的重组HD11细胞中检测到了mRNA的表达，但用IBV阳性血清进行蛋白免疫分析时未检测到S1蛋白水平的表达。笔者认为可能在细胞中表达的S1蛋白被免疫蛋白酶体识别而被剪切成短肽，因此在Western Blot中无法检测到目的蛋白大小的条带。由此推测在外体形成的过程中，可以保护载入外体的病毒蛋白，免受巨噬细胞蛋白酶体通路的降解。这可能是病毒蛋白逃逸免疫识别的一种方式，值得进一步研究。

本研究利用透射电镜观察到的形态符合外体在透射电镜中的结构特点(图4-A)。同时，用纳米流式检测技术测定外体的粒径范围为70～80 nm，符合外体粒径的30～150 nm范围（图4-B）。用蛋白免疫印迹方法，从重组外体纯化产物中可检测到病毒蛋白S1以及外体标志蛋白CD63，TSG101的表达，同时并未检测到细胞骨架蛋白Tubulin的表达，从而排除细胞组分残留的影响。此外，在重组外体中检测到S1蛋白分子量大小在100 kDu左右（图5），大于预测分子量56 kDu。这是由于S1蛋白中有17个糖基化位点（Asn-X-Ser/Thr，X可为脯氨酸的任一氨基酸)，经完全糖基化后的分子量为98 kDu[21]。而根据已有报道，通过原核或者真核表达载体所表达的重组IBV S1蛋白的分子量均小于98 kDu[22-24]。综上所述，本研究成功纯化到携带IBV S1抗原的HD11源外体，并且该外体中表达的S1抗原具有高度糖基化修饰，与病毒感染过程中S1蛋白的天然构象接近。本研究结果可为今后应用鸡源巨噬细胞分泌的外体作为抗原载体的相关禽病疫苗研发提供重要的参考数据。