马立克氏病 (Marek’s disease, MD) 是由阿尔法疱疹病毒引起的一种鸡上的慢性传染性疾病。马立克氏病对世界家禽业有着巨大危害。马立克氏病病毒 (Marek’s disease virus, MDV) 感染后的鸡会发生淋巴瘤、短时的麻痹瘫痪、动脉粥样硬化、永久性的神经系统损伤以及死亡；轻微的感染也会引起蛋鸡产蛋率、蛋重等生产性状显著下降。马立克氏病的感染过程一般分为4个阶段：1) 早期溶细胞感染阶段；2) 潜伏阶段；3) 二次溶细胞、免疫抑制阶段；4) 病毒增值及肿瘤形成阶段。在感染过程中，病毒颗粒会扩散到鸡的毛囊上皮细胞，成熟的病毒通过毛囊释放到环境中，所以马立克氏病极易扩散与爆发。疫苗是现如今控制马立克氏病的最主要的手段，血清1型疫苗、血清2型疫苗和血清3型疫苗HVT、以及由这些疫苗混合成的二价、多价苗都有较广使用。疫苗通常在1日龄时接种。除了正确的疫苗接种措施，饲养环境的卫生与鸡舍定期消毒等工作同样重要。但是，疫苗的效率赶不上病毒的不断变异与扩散，所以培育抗病品种才是解决马立克氏病最根本且长效的方法。

图1 马立克氏病的临床症状 (Courtesy of Dr. Jean Sander and Dr. John Dunn)

图片来源：https://www.merckvetmanual.com/poultry/neoplasms/marek’s-disease-in-poultry

基因组结构变异指发生于生物基因组染色体结构上的变异，其包含有拷贝数变异 (copy-number variants, CNV)，插入与缺失 (insertion & deletion, InDel)，易位 (translocation) 和倒置 (Inversion) 等。已有多项研究发现，单核苷酸多态性 (single-nucleotide polymorphism, SNP) 和基因组结构变异与多种遗传疾病与遗传紊乱相关。以现有的两个对马立克氏病抗性差异巨大的近交系群体为样本，通过生物信息学手段分析两个群体间特异的基因组结构变异，有助于我们从基因组层面解析马立克氏病遗传抗性的机制。在马立克氏病抗性系中，我们共找到4 904 832个SNPs和742 041个InDels；在马立克氏病易感系中共找到4 882 010个SNPs和744 783个InDels；每个个体平均检测到1639个拷贝数变异，平均大小在8057bp。对这些拷贝数变异进行合并，共得到5680个拷贝数变异区间（CNVR）, 大小从1kb到543kb不等，覆盖了2.76%的基因组范围。其中抗性品系内特异的结构变异有1 676 196个SNPs和242 126个InDels；易感品系内特异的SNPs有1 510 499个，特异的InDels有227 013个。在抗性系和易感系中分别筛选出了1546个和1866个系特异性的CNVR，在这些特异的CNVR中，易感系特异性的CNVR内的基因参与了丝裂原蛋白激酶（MAPK）信号通路的调控，这个通路已经被证明是参与宿主感染马立克氏病病毒后机体免疫反应的重要通路之一（图2）。

图2 丝裂原蛋白激酶（MAPK）信号通路的示意图

注：红色星星表示位于易感品系特异的CNVR内的基因

非编码RNA是一种不翻译成蛋白质的RNA分子。这些由所谓的“垃圾DNA”转录而来的RNA分子被越来越多的科学家证实其在各种生物学过程中发挥了重要作用。本项目重点研究两种非编码RNA对马立克氏病遗传抗性的影响，一种是长非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)，另一种是微小RNA (miRNA)。lncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA；miRNA则是长度在22个核苷酸左右的非编码RNA。这两种RNA与细胞增殖分化、癌症的发生以及基因的印迹等过程中有很重要的角色。相对于人和其他模式动物而言，关于鸡的非编码RNA的研究还比较少，本项目利用感染与未感染马立克氏病病毒的鸡群为样本，探索lncRNA和miRNA在宿主马立克氏病感染过程中的表达特性及其分子功能。实验发现gga-miR-181a, gga-miR-130a, gga-miR-103-3p, gga-miR-26a和gga-miR-219b等在感染和未感染的鸡脾脏等组织中差异表达，说明这些miRNAs在马立克氏病感染的过程中与靶基因结合发挥了一定的作用。为了深入探究这些miRNAs的作用机理，实验预测并验证了这些miRNAs的靶基因以及与靶基因的作用位点，发现这些miRNAs能够通过控制靶基因的表达，进而控制马立克氏病肿瘤细胞的增值和迁移效率。图3展示的是gga-miR-219b与其靶基因BCL11B所参与的细胞凋亡的调控网络。在lncRNAs方面，项目分别甄别了鸡法氏囊和脾脏中的未知的lncRNAs，同时找到了在感染和未感染个体间差异表达的lncRNAs，预测了这些lncRNA可能的潜在靶基因并对部分lncRNAs的分子功能进行验证，实验发现linc-SATB1和linc-GALMD3能通过顺式和反式效应控制其附近或相隔较远的基因的表达，进而调控细胞周期以及马立克氏病病毒的复制。在脾脏中，实验发现5条与免疫调控和细胞周期调控紧密相关的lncRNAs，这5条lncRNAs可能参与宿主免疫系统和细胞凋亡的调控（图4）。这些结果极大丰富了人们对非编码RNA在马立克氏病病理学过程和肿瘤形成过程的所扮演的角色的认知，也填补了关于鸡非编码RNA研究的较大空白。

图3 gga-miR-219b与其靶基因BCL11B参与调控细胞凋亡示意图

图4 五条鸡脾脏中的lncRNAs与其潜在靶基因的作用关系

DNA甲基化是指甲基基团 (CH3) 添加到DNA分子上的过程。胞嘧啶的甲基化最为常见，且在动物中甲基化更多的发生于CpG双核苷酸位点。发生于基因启动子区域的DNA甲基化往往抑制基因的表达，作为生物生长发育必不可少的环节之一，DNA甲基化影响着基因印迹、性染色体随机失活、细胞凋亡以及癌症的发生。本项目描绘了马立克氏病感染的不同阶段的DNA甲基化水平，发现随着感染的持续，抗性品系和易感品系之间的部分基因的DNA甲基化水平有着巨大的差异。易感品系在感染后10天与感染后21天时相比，大量与免疫细胞激活分化相关的基因发生了甲基化变异，暗示着这些基因表达量的变化；而在抗性品系在感染后10天与感染后21天的比较中，与免疫细胞激活分化相关的基因的甲基化水平较为稳定（图5）。这从表观基因组学层面解释了抗性品系相对于易感品系不易于发生马立克氏病诱导的肿瘤的原因。在感染组与未感染组的比较中，易感品系在感染后10和21天时，感染组与未感染组间大量免疫相关基因存在甲基化水平差异；反观抗性品系感染后5和21天时感染组与未感染组间的甲基化水平，两组间免疫相关基因的甲基化水平趋于一致，只有在感染后10天时有着较大的差异（图6）。

图5 抗性品系和易感品系在不同感染时间点差异甲基化区域所覆盖到的基因的功能分析

注：图中圆点越大代表在这一功能条目中的基因数量越大；颜色越深代表FDR值越小

图6 抗性品系和易感品系中感染和未感染组之间的差异甲基化区域所覆盖到的基因的功能分析

本项目通过基因组学和表观基因组学的研究，综合解析了鸡马立克氏病遗传抗性的分子机制，为后续MD抗性机理研究与抗病育种工作奠定基础。

国家自然科学基金项目名称：鸡马立克氏病遗传抗性的分子机制研究

项目批准号：31320103905