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作者：

李致宏

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摘要：

C型尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease type C,NPC)是一种致命的神经内脏脂质沉积病,其最显著的异常细胞表型为游离胆固醇沉积于溶酶体内,导致胆固醇从溶酶体向细胞内其他部位的运输障碍。尼曼匹克病患者中,约95%是由于NPC1基因突变所致,而另外的5%则是由NPC2基因突变引起的。作为重要的胞内胆固醇运输受体蛋白,NPC1蛋白还被报道参与到多种病毒侵染宿主细胞的过程中,包括丝状病毒科、逆转录病毒科、披膜病毒科以及黄病毒科中的多种病毒侵染都与NPC1蛋白存在着密切的相关,充分说明NPC1蛋白不仅对于细胞正常生理活动至关重要,同时也是一种极为重要的病毒侵染因子协助病毒进入宿主细胞。杆状病毒是一类古老的DNA双链环状病毒,主要侵染无脊椎动物,已报道的宿主超过600多种。由于杆状病毒能物种特异性的感染节肢动物,生物安全性高,常被作为生物杀虫剂进行应用,同时也被开发成为蛋白表达系统进行外源基因进行真核表达。此外,杆状病毒还能够作为一个强大的生物工具在包括人类、牛、鱼类、鸟类,甚至一些原始的细胞(如胚胎干细胞等)中进行基因转导。虽然有报道称宿主的硫酸肝素和磷脂质等分子可能参与到杆状病毒粘附或结合细胞表面的过程,但是到目前为止,杆状病毒侵染宿主的受体仍是未知的。已有研究发现家蚕BmPP蛋白(Bombyx mori promoting protein),NPC2家族成员之一,能够促进BmNPV侵染家蚕Bo Mo细胞,推测NPC2蛋白参与到了BmNPV入侵宿主细胞的过程中,但是具体的分子机制并不清楚。考虑到NPC2与NPC1共同协作参与胞内运输胆固醇,且NPC1能够参与到多种病毒的侵染,那么家蚕中NPC1在BmNPV侵染过程是否也扮演着某种角色呢?基于此,本研究克隆了Bmnpc1基因,并分析了序列特征,进行原核表达和抗体制备以及BmNPC1定位分析；通过NPC1抑制剂预处理家蚕胚胎细胞分析NPC1与杆状病毒侵染是否存在直接的关系；随后,通过RNA干扰和基因敲除技术降低NPC1表达量来进一步确定BmNPC1与杆状病毒之间的关系；最后通过免疫共沉淀和酵母双杂交实验明确杆状病毒BmNPV的关键膜融合蛋白GP64能与BmNPC1发生相互作用,从而揭示了BmNPC1参与杆状病毒侵染的作用机制。主要研究结果如下:1.家蚕Bmnpc1生物信息学分析本研究利用公共数据库获取一条家蚕的npc1序列(XP_012544312.1),通过序列分析软件和在线网站对Bmnpc1的基因序列特征进行了分析,Bmnpc1序列与NPC1家族成员相似,都包含一个信号肽和13个跨膜域,并形成了3个比较大的膜外功能区,分别命名为NPC1-A,NPC1-C和NPC1-I；亚细胞定位预测结果显示该蛋白主要定位于质膜、内吞体以及溶酶体膜上,这与典型NPC1蛋白亚细胞定位结果一致。BmNPC1序列含有多个潜在的糖基化和磷酸化修饰位点暗示其可能是一个糖蛋白。结构域预测发现BmNPC1具有NPC1家族典型的三个功能域,分别是NTD结构域(N-terminal domain),SSD结构域(Sterol-sensing domain)及PTC结构域(patched domain)。对功能区进行多重序列比对分析,结果显示SSD结构域和PTC结构域在脊椎动物和无脊椎动物中都具有较高的保守性,而NTD结构域的保守性最低,但存在18个保守的半胱氨酸位点,推测仍然行使着较为保守的生物学功能。三维结构预测结果显示BmNPC1的空间排布与h NPC1蛋白结构极为相似,推测它们在细胞内行使着相似的生物学功能,即在内吞体及溶酶体中参与胆固醇的识别和胞内运输过程。系统发育分析发现家蚕NPC1与果蝇、蜜蜂、烟蚜等节肢动物可以聚为一枝,并且能与人类、家兔、斑马鱼等脊椎动物的NPC1聚为一大枝,说明家蚕BmNPC1与双翅目、鞘翅目和膜翅目之间进化关系最近,与脊椎动物的NPC1也具有较近的进化关系,但与原虫、真菌以及线虫等物种的进化关系较远。NPC1的全序列多重序列比对结果显示NPC1序列在各物种中非常保守。根据以上分析,说明NPC1是一个极为保守的胞内胆固醇转运蛋白,本研究选定BmNPC1作为研究靶标进行后期的克隆表达和功能试验。2.家蚕BmNPC1的蛋白表达及定位分析对Bmnpc1的全长CDS序列进行克隆,成功获得一条长度约4000bp的扩增片段,经测序与Bmnpc1电子序列一致。全基因组芯片表达数据结果显示Bmnpc1基因在家蚕各个组织中均能检测到转录,其中头部、中肠、马氏管和精巢中转录水平较高,而脂肪体、丝腺等组织中的转录水平较低。利用h NPC1多克隆抗体进行免疫印迹分析,结果显示在家蚕总蛋白中杂交到一条约为140 k Da左右的条带,与家蚕BmNPC1蛋白预测大小一致。间接免疫荧光实验分析发现经hNPC1抗体孵育的BmE细胞边缘以及细胞内部均存在明显荧光信号,推测家蚕BmNPC1蛋白定位于BmE细胞的表面以及细胞内的内吞体、溶酶体等囊泡膜上。根据基因的序列信息,设计Bmnpc1膜外区NPC1-A和NPC1-I的特异性引物,构建原核表达载体p ET32a-BmNPC1-A和p ET32a-BmNPC1-I,经诱导表达获得相应的重组蛋白,通过亲和层析方法纯化重组蛋白,并以纯化得到的目的蛋白为抗原制备相应多克隆抗体。同时,通过对BmNPC1-C区的序列进行生物信息学分析,合成肽段TDPVELWASPTSRS(氨基酸第409~422位)作为候选免疫肽段,将其与KLH标签偶联后免疫新西兰大白兔制备BmNPC1-C区的多克隆抗体。获得的多克隆抗体都能特异性识别靶标蛋白。3.BmNPC1在杆状病毒BmNPV侵染宿主细胞中的作用分析为验证NPC1与杆状病毒的侵染是否相关,本研究通过NPC1抑制剂(丙咪嗪和U18666A)分别预孵育家蚕胚胎细胞后进行重组杆状病毒(r BmNPV-EGFP)攻毒实验来展开调查,结果显示抑制剂实验组中NPV侵染后产生的EGFP荧光蛋白量显著降低；荧光定量PCR结果显示,100μM的丙咪嗪和10μM的U18666A分别预孵育BmE细胞后,病毒DNA量分别降低为对照组的27%和10%左右,表明两种NPC1抑制剂均可有效抑制杆状病毒在BmE细胞中的侵染和增殖。为进一步验证BmNPV侵染受抑制与NPC1直接相关,对Bmnpc1基因进行RNA干扰后再进行攻毒实验,结果显示干涉组荧光细胞阳性率显著低于对照组；荧光定量PCR结果也显示实验组的病毒DNA量显著低于对照组,呈极显著差异(***P