多聚酶链式反应（PCR）扩增DNA片段及琼脂糖凝胶电泳产物检测

一、实验目的：

1、了解PCR技术的基本操作

2、理解PCR的原理

3、讨论PCR的应用

二、实验原理：

PCR是一种在体外模拟细胞内环境进行迅速扩增DNA片段的技术，这一技术需要模板、四种脱氧核苷酸等组分条件外，还需要不同温度环境以进行DNA的解旋和聚

1、PCR反应组分

细胞内DNA复制条件分析：

此外，试验中用到的还有Mgcl2，Mg2+能激活酶的活性；10* Buffer 缓冲液，为Taq酶提供合适的PH条件。

2、PCR反应条件

PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。

PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸。

(!)变性（模板DNA解旋）

模板DNA经加热至90℃以上。一定时间后，使模板DNA双链解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。

(2)复性（退火）

模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

(3)延伸

DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。

3、PCR产物的检测

(1)紫外分光光度计

DNA在260nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，可以通过与蒸馏水的对比进而计算扩增出DNA的含量。

(2)琼脂糖凝胶电泳

DNA在电厂作用下，可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与DNA片段的长度成负相关，与电压强度成正比，因此可以分离不同长度的DNA。在有DNA marker（不同已知碱基对大小的DNA片段的混合物）的条件下，由于不同碱基大小的DNA片段在琼脂糖凝胶上涌动的速度不同，因此电泳完毕后会出现在胶块的不同位置。通过将扩增出的DNA片段与已知的条带做比较，可以大概推测出该片段的碱基对的大小。如果要进一步检测其大小，可以换另外规格的DNA marker 继续电泳。核酸荧光染料可以与DNA嵌合，一起电泳，DNA图谱观察仪可以激发特定的蓝色光源，荧光染料在该光照射下可见到荧光，荧光的亮度与DNA大小成正比。

…… …… 余下全文