③加样：用微量移液器取10μl各种不同浓度的参考血清准确加入免疫板的孔内，每一浓度均加两个孔，然后用上述加样方法，取10μl适宜稀释度的待测血清，加入免疫反应板的孔内。

④反应：将加样的琼脂板置水平湿盘内，于37℃温箱反应24～48小时后，取出反应板，用标尺测其沉淀环直径并记录。

⑤标准曲线的绘制：以各浓度标准抗原的沉淀环直径为纵坐标，相应孔中抗原Ig浓度含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线（见图6-1）。

⑥待测标本Ig（IgG、IgA、IgM）含量的计算：以待测标本的沉淀环直径查标准曲线，将查得的Ig含量乘其稀释倍数，即得该标本的Ig含量。

⑦几种试剂的配制：

A.1.5%琼脂的配制：秤取1.5g琼脂，用含0.01%柳硫汞的生理盐水100ml溶解，加热使之呈液体状。

B. 0.01 mol/L pH 7.2PBS的配制：先配制0.2 mol/L Na2HPO4及NaH2PO4溶液，取72ml 0.2 mol/L Na2HPO4与28ml0.2 mol/L NaH2PO4混合，然后用0.85%NaCl溶液稀释20倍即成。

图6-1 琼脂单向扩散试验的标准曲线图

（3）注意事项

①制备琼脂板时温度不宜过高使抗体变性失活，亦不宜太低，以免使琼脂凝固不匀。

②沉淀环的直径均已mm为测量单位。

2.双向扩散

（1）原理

双向扩散为定性试验。将可溶性抗原与相应抗体分别加入琼脂板上相对应的孔内，两者相互扩散，在比例适宜处形成沉淀线。如抗原与抗体无关则不形成沉淀线。此实验用来检测抗原或抗体的纯度，亦可用已知的抗原（抗体）来测未知的抗体（抗原）。临床上常用于检测甲胎蛋白（AFP），作为原发性肝癌等的辅助诊断。

（2）方法

①琼脂反应板的制备：取融化好的1%盐水琼脂3.3ml,置琼脂板内，待冷即制成琼脂反应板。

②打孔：用打孔器在琼脂板上打孔，孔距6mm,呈梅花形排列，即中间一孔，周围六孔，将孔内琼脂用注射器针头挑出。

③加样：用微量移液器取10μlAFP免疫血清准确加入中央孔内，上下孔各加10μl脐带血清作为阳性对照。其余孔加等量的待测血清。

④反应：将加好样的琼脂板置水平湿盘内，于37℃温箱反应24小时。

⑤结果分析：待测标本如出现沉淀线，且与阳性对照的沉淀线吻合，则为阳性反应。如无沉淀线出现或是与阳性对照沉淀线交叉的沉淀线则为阴性（见图6-2）。

图6-2 双向扩散结果示意图（梅花孔法）

（3）注意事项

①加样时，注意不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形状。

②反应时间要适宜。时间过长，沉淀线可解离至假阴性；时间过短，则沉淀线不出现。

③就爱样时抗体、阳性血清及待测标本应各用一支加样器，以免混淆，影响实验结果。

二、免疫电泳

1.原理

免疫电泳是免疫扩散与电泳相结合的免疫学分析技术，具有极高的分辨力。主要用于抗原组成的定性分析。免疫电泳实际上分为两个步骤：①电泳，待测抗原在琼脂中进行区带电泳。由于不同蛋白质组份的大小、质量及所带的电荷不同，在电场的作用下，可将不同组份区分开。②琼脂扩散，电泳后，在琼脂槽内加入相应的抗血清，进行免疫扩散，根据出现沉淀线的数量及位置即可分析抗原的组份机器性质。

2.方法

（1）琼脂反应板的制备：将载玻片置水平台面，并将塑料条置于玻片上面，然后取4ml融化好的1%琼脂糖与玻片上，待自然冷凝后取出塑料条，即成琼脂槽。最后根据需要在琼脂板上打孔，挑去孔内琼脂。

（2）加样：用微量移液器取10μl待测血清准确加入孔内。

（3）电泳：用电泳仪（一般生化检验分析蛋白的电泳仪即可）电泳，选择电压一般为3～4V/cm，电泳时间为1.5小时。

（4）扩散：取兔抗人血清加入琼脂槽。置湿盒内，37℃24小时后观察结果。

（5）结果观察：在琼脂槽的两边出现相对应的沉淀线。

3.注意事项

（1）有时抗原抗体形成的沉淀线很弱，肉眼不易观察，可以染色。

（2）染色标本应在白色背景下观察，不染色标本需在斜射光的暗色背景下观察。

（3）琼脂板两端需用滤纸等物作桥，与桥内缓冲液接通。搭桥要完全紧密接触。以防电流不均发生沉淀线偏斜。

三、火箭免疫电泳

1.原理

火箭免疫电泳是将电泳与单向扩散结合的一种免疫技术。将抗体溶入琼脂后制板，在琼脂板的一侧打孔，加入待检样品及不同浓度的标准抗原。电泳时抗原在含定量抗体的琼脂中向正极移动，并形成浓度梯度，在适宜的部位形成火箭状的沉淀峰。沉淀峰的高度与抗原的含量成正比，故可定量测定抗原。

2.方法

（1）制板：将抗体血清按一定比例与溶化好的1.5 %琼脂在56 ℃水浴中混匀，迅速浇注成2 mm厚的琼脂板。

（2）打孔：待琼脂凝固后，于距玻板一长边10mm处，以3mm孔径打孔器打孔一排，孔距5mm。

（3）加样：取不同浓度的标准抗原及待测抗原各10μl加入孔中。

（4）电泳：将抗原孔置于负极端，进行电泳（3V/cm），时间6-8小时。

3.结果

（1）标准曲线的绘制：以沉淀峰高为纵坐标，抗原浓度为横坐标，在半对数纸上绘图。

（2）待测抗原含量的测定：量出待测孔沉淀峰高，查标准曲线可查得抗原的相应浓度，乘其稀释倍数即得抗原的含量（图6-3）。

4.注意事项

（1）如采用高压电泳时（8-10 V/cm），需配冷却装置。

（2）正式实验前应做预试，调整好抗原、抗体的比例。

（3）待测样本多时为避免先加样孔抗原自由扩散造成电泳后出现孔周扩大的沉淀峰，可先将琼脂放入电泳槽，在10V/cm电泳状态下加样。

（4）搭桥为火箭电泳的关键环节之一，桥宽应与琼脂膜一致。

【实验报告与思考题】

1.测定未知抗体及测其纯度时应选何种打孔模式？三孔模式与梅花样模式适合于何种性质的双扩？

2.免疫电泳与双向扩散比较其优点何在？

3.试分析下述火箭电泳中可能出现的现象：（1）无沉淀峰（2）出现几个峰（3）峰扭曲

4.在火箭电泳中，火箭峰逐渐变高且浓度变淡是何原因？应如何调整至正常？

四、对流免疫电泳

对流免疫电泳(counter immunoelectrophoresis, CIEP) 是建立在免疫沉淀反应的基础上，通以电流，使蛋白质抗原、抗体在电场中作定向加速度免疫双扩散，从而加速沉淀的形成。

1.原理

一般抗体（IgG）的等电点为pH5—9，血清蛋白抗原的等电点为pH4—5，在pH8.2~8.6的缓冲溶液中，抗体所带负电荷较少，正电荷较多，而且分子在直流电场中它易受溶液中负电离子的吸引作用及溶液的电渗作用而向负极迁移；在同样条件下，抗原所带正电荷少负电荷多，分子也较少，电泳迁移快，虽也受电渗影响，但仍向正极泳动，若抗原抗体相对应，则在两者相遇于最适比例形成白色沉淀线，此即为对流免疫电泳的阳性结果（见图6-4）。

图6-4 对流免疫电泳

2.试剂与器材

（1）抗原：人血清。

（2）抗体：抗人血清。

（3）0.05mol/L pH 8.6巴比妥缓冲液。

（4）1.5%离子琼脂：取备用的3%琼脂块（蒸馏水配置），加热融化后加入等体积的巴比妥缓冲液，加热混匀备用。

（5）0.05%氨基黑10B。

（6）电泳槽、电泳仪。

（7）其他物品：玻片、吸管、打孔器、毛细滴管等。

3.操作方法

（1）制备琼脂板：以吸管取琼脂4ml趁热倒在载玻片上，琼脂凝固后即成离子琼脂板，然后按图6-4打孔，用注射器针头挑出孔内凝胶，再用热融琼脂封闭孔底，然后将琼脂板置于电泳槽中，槽两侧搭用纱布或滤纸作盐桥。

（2）加样：将待测抗原样品10μl加在阴极侧孔内，加样量与琼脂面平。

（3）电泳：电势梯度4 V/cm长（恒压）或者电流3-4mA/cm宽（恒流），电泳0.5-1小时。

4.结果判断

电泳毕，关闭电源，取出琼脂板。在黑色背景上方，透过散射光线，首先观察阳性对照组、阴性对照组的白色沉淀线是否出现；再看试验孔，如孔间未出现这样的沉淀线，则该待检血清为阴性血清（沉淀线如不清晰，可将琼脂板放入湿盒37℃或室温数小时。必要时可按常规洗涤、染色）。

【实验讨论】

1.本方法宜采用带有适当电渗的琼脂为介质，应注意电渗的方向和强度，电渗作用过强会使多数蛋白质向阴极移动。

2.如果抗原也是免疫球蛋白，或抗原抗体的扩散率比较接近，这种情况一般不宜做对流免疫电泳。

3.试分析还有哪些因素会影响电泳结果？

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