PCR假阴性, 英文是PCR false-negative, 是指不出现特异扩增带。

PCR假阴性的原因可能有：

引物设计不合理，酶失活或酶量不足，模板量太少，退火温度不合适，循环次数过少，产物未及时电泳检测等。

PCR反应的关键环节有

①模板核酸的制备，

②引物的质量与特异性，

③酶的质量及活性

④PCR循环条件。 寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：

①模板中含有杂蛋白质，

②模板中含有 Taq酶抑制剂，

③模板中蛋白质没有消化除净， 特别是染色体中的组蛋白，

④在提取制备模板时丢失过多， 或吸入酚。

⑤模板核酸变性不彻底。 在酶和引物质量好时， 不出现扩增带， 极有可能是标本的消化处理， 模板核酸提取过程出了毛病， 因而要配制有效而稳定的消化处理液， 其程序亦应固定不宜随意更改。

酶失活： 需更换新酶， 或新旧两种酶同时使用， 以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。 需注意的是有时忘加 Taq 酶或溴乙锭。

引物： 引物质量、 引物的浓度、 两条引物的浓度是否对称， 是 PCR 失败或扩增条带不理想、 容易弥散的常见原因。 有些批号的引物合成质量有问题， 两条引物一条浓度高， 一条浓度低， 造成低效率的不对称扩增， 对策为：

①选定一个好的引物合成单位。

②引物的浓度不仅要看 OD值， 更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳， 一定要有引物条带出现， 而且两引物带的亮度应大体一致， 如一条引物有条带， 一条引物无条带， 此时做 PCR 有可能失败， 应和引物合成单位协商解决。 如一条引物亮度高， 一条亮度低， 在稀释引物时要平衡其浓度。

③引物应高浓度小量分装保存， 防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分， 导致引物变质降解失效。

④引物设计不合理， 如引物长度不够， 引物之间形成二聚体等。

Mg2+浓度： Mg2+离子浓度对 PCR 扩增效率影响很大， 浓度过高可降低 PCR扩增的特异性， 浓度过低则影响 PCR 扩增产量甚至使 PCR 扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变： 通常进行 PCR 扩增采用的体积为 20ul、 30ul、 50ul。 或 100ul， 应用多大体积进行 PCR 扩增， 是根据科研和临床检测不同目的而设定， 在做小体积如 20ul后， 再做大体积时， 一定要模索条件， 否则容易失败。

物理原因： 变性对 PCR 扩增来说相当重要， 如变性温度低， 变性时间短， 极有可能出现假阴性; 退火温度过低， 可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物

与模板的结合而降低 PCR 扩增效率。 有时还有必要用标准的温度计， 检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、 退火和延伸温度， 这也是 PCR 失败的原因之一。

靶序列变异： 如靶序列发生突变或缺失， 影响引物与模板特异性结合， 或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列， 其 PCR 扩增是不会成功的。

PCR假阳性, 英文PCR false-positive, 是指在没有目标DNA或RNA的情况下，PCR检测结果错误地显示为阳性。出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致， 有时其条带更整齐， 亮度更高。

PCR假阴性的原因可能由多种因素导致，美格君认为主要包括实验污染、试剂污染、PCR扩增的非特异性反应或仪器的误读。

PCR假阳性的常见原因：

引物设计不合适： 选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性， 因而在进行 PCR 扩增时， 扩增出的 PCR 产物为非目的性的序列。 靶序列太短或引物太短， 容易出现假阳性。 需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：

这种污染有两种原因： 一是整个基因组或大片段的交叉污染， 导致假阳性。 这种假阳性可用以下方法解决：

①操作时应小心轻柔， 防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。

②除酶及不能耐高温的物质外， 所有试剂或器材均应高压消毒。 所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。

③必要时， 在加标本前， 反应管和试剂用紫外线照射， 以破坏存在的核酸。 二是空气中的小片段核酸污染， 这些小片段比靶序列短， 但有一定的同源性。 可互相拼接， 与引物互补后， 可扩增出 PCR 产物， 而导致假阳性的产生， 可用巢式 PCR 方法来减轻或消除。

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