（一）标本前处理

标本液化、浓缩及去除宿主核酸等前处理方法和设备使用应标准化。所有标本应具有唯一标识，防止在信息录入和标本分拣过程中交叉污染。根据申请要求提前准备被检测微生物所需的文库资料及生物信息分析软件。建立临床标本的前处理程序，包括复杂标本、微量标本和组织标本的前处理程序，针对真菌和/或分枝杆菌等特殊微生物的破壁处理程序。建立RNA病毒、微生物游离核酸测序的前处理方法。建立组织标本研磨方法，具体方法见表3。

（二）核酸提取

1.使用经性能确认的核酸提取试剂：临床标本中存在不同类型的病原微生物，核酸提取方法的可重复性和提取效率对保证核酸的完整性及纯度至关重要。实验室应根据临床标本类型和微生物种类建立针对性的标准化提取程序。建议使用经性能验证的商品化提取试剂及设备。

2.核酸质量验证：（1）高质量的DNA A260/A280应在1.7~1.9，A260/A230应>2，可用1%琼脂糖凝胶电泳验证DNA质量（无杂带、无拖尾、背景无蛋白污染）。（2）DNA完整性（如Agilent 2100 Bioanalyzer）检测，如果大部分片段在200 nt（血浆游离DNA除外，140 nt）以下说明DNA降解严重，需重提。（3）高质量的RNA A260/A280应在1.8~2.0，A260/A230应>2。（4）微量的核酸采用Qubit荧光染料法进行定量测定［15］。

3.核酸含量极低样本的处理：如CSF、房水等，应在标本中加50 μl ATL（DX）研磨珠，低频震荡10 min，离心后取150 μl。加入150 μl裂解液和8 μl蛋白酶K，涡旋震荡混匀30 s，56 ℃恒温震荡15 min（若无恒温震荡仪，可用金属浴代替，期间每3 min混匀1次）；取裂解后的样本300 μl，加入磁珠240 μl，震荡混匀，室温静置5 min，上清提核酸。按照商品化的操作说明进行。

4.去除人源DNA的方法：多数临床标本存在大量宿主细胞和宿主游离核酸，微生物核酸丰度相对较低。因此，在核酸提取环节中可考虑建立高效去宿主DNA方法，提高mNGS微生物检测的灵敏度［4， 48］，去除人源核酸的方法选择需要结合临床检测目的，举例如下。

去污剂处理：因人源细胞的细胞膜较微生物外壁脆弱，在核酸提取前用温和去污剂（如皂苷）裂解宿主细胞释放DNA，再用脱氧核糖核酸酶Ⅰ降解人源DNA，通常可使微生物富集效率提高1 000倍［49］。

低渗溶液破坏宿主细胞：使用细胞膜不透性的叠氮碘化丙锭结合暴露在溶液中的宿主DNA［48］。

抗甲基化DNA磁珠：因人源DNA甲基化程度高，大多数微生物基因组中缺乏甲基化DNA，使用抗甲基化DNA磁珠可有效去除人源DNA，可实现3~5倍富集［26］。

使用CRISPR-Cas9（基因编辑技术）剥离目标序列：此法对构建RNA文库较为有利，可提高非编码rRNA序列含量，但对DNA文库构建意义不大，不推荐花费更大财力去除全部人源DNA。

5.qPCR预估人源核酸的去除效率：去除宿主DNA后，对宿主及微生物常用的标志基因，如β肌动蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因和16S rRNA基因等，进行实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）定量检测，通过经验积累大概预估宿主残余比例及有效数据比例，必要时可提高测序数据量。

（三）文库制备

文库制备是将基因组DNA片段化并在片段末端连接寡核苷酸接头的过程，文库质量直接影响测序数据质量。目前常用的建库方法有超声波打断建库、酶切建库及转座酶建库等，选用操作简单的方法对降低污染有利。

1.明确核酸质量及文库产出标准：实验室根据文库制备方法及测序平台明确起始核酸质量标准（纯度、浓度）及文库产出标准（文库浓度、片段大小等）。

2.建议使用配套试剂：若起始DNA在10 ng以上，可采用普通建库试剂盒；若DNA在100 pg~10 ng之间，则采用超微量DNA建库试剂盒；若DNA量低于下限，应先行全基因组扩增，再进行建库。

3.构建RNA文库：逆转录前需在冰上操作，防止RNA降解。应添加RNA酶抑制剂，必要时在建库前采用杂交捕获法或核糖体分离法去除rRNA［15］。

4.文库质量：可采用Qubit荧光染料法检测文库浓度，qPCR检测文库中有效连接接头的核酸浓度。上机前需根据不同的测序平台对文库浓度的要求进行。高质量的文库DNA，其A260/A280通常在1.75~2.00。此外，还应采用生物分析设备检测文库片段大小及峰型，文库片段大小为插入片段和接头序列的总长度，合格文库插入片段长度大于100 bp，文库应主峰明显、无杂峰、无接头、无引物二聚体［15］。

建议6 实验室应具备针对不同类型临床标本的前处理方法，尤其针对复杂和极微量标本应具备经验证的灵敏的手段。无论DNA还是RNA核酸提取质量应满足测序要求。在核酸提取的过程中应引入经验证的降低人源核酸处理方法。推荐使用配套试剂构建文库，根据初始核酸浓度选择文库建库试剂盒，若DNA量低于下限应先行全基因组扩增再进行建库，文库核酸浓度、纯度及长度应达到测序（包括靶向测序和宏基因组测序）要求。文库制备方法需用已知临床标本或模拟样品或质控品进行验证或开展实验室间比对，合格后方可用于临床。

（四）上机测序

测序数据量指每个样本测序所得的序列数或碱基数（nt），二者可相互转换，一般宏基因组测序用序列数表示。测序数据量与预期用途（如微生物检测、耐药基因检测、微生物组学分析、宏基因组学分析等）、样本中微生物与人源核酸占比、测序灵敏度以及测序成本等因素相关。

mNGS微生物检测的灵敏度与标本人源核酸含量有关，不同类型临床样本人源核酸平均含量不一样，为保证结果可靠性，在相同样本处理和核酸提取方法时，通常不同类型临床标本推荐不同测序数据量，原则上背景简单的标本如CSF、血浆等（人源核酸含量低）较低的测序数据量即可满足病原微生物检出。在条件允许的情况下可增加测序数据量以提高检测灵敏度。可通过数据抽样，即从下机数据中（如20 M）随机抽取15 M组成一个模拟的15 M测序数据集模拟分析不同测序数据量、不同物种的检测限，从而最终确定不同标本类型的最佳测序数据量。通常靶向测序的数据量应≥3万条序列，宏基因组测序鸟枪法测序数据量应≥2 000万（20 million，20 M）高质量序列，准确度Q30比例≥85%。也有文献推荐CSF600万条（6 M）序列［26， 35］、血液游离DNA 2 400万条序列（24 M）［50］、咽拭子病毒检测1 000万条（10M）序列［51］等。测序数据量提升可显著提高灵敏度，以血流感染为例，每个标本平均20 M序列时，总体灵敏度为31%［52］，每个标本平均24 M序列时，总体灵敏度达到48%［50］，当每个标本平均数据量达到33 M序列时，总体灵敏度达到71%［53］。

（五）生物信息学分析

生物信息分析是对测序得到的原始序列进行数据分析和处理的过程，以预定程序执行。该流程由多个软件组成，包括去除人源序列、处理微生物序列及相关元数据、检测候选目标微生物，实现检测与数据的转换。数据分析中应考虑预期用途、软硬件功能、数据存储位置、版本号及信息备份等。同时应确保患者信息安全，设置读取规则、人员权限、数据异常提取的警报。目前已经具有商业化的自动分析系统可以选择，实验室也可选择与国际同步的算法和软件，搭建实验室自己的分析流程，搭建过程中应选已知阴阳性样本或质控品进行生物信息学分析能力模拟测试。

1.序列质量：碱基质量值是衡量测序质量的重要指标，用于评估下机序列数的准确度。质量值（Q）越高代表碱基被测错的概率（P）越低，两者关系为Q=-10 lgP。Q20对应的测序错误概率为1%、准确率99%。Q30对应的测序错误概率为1‰、准确率99.9%。常用Q20和Q30分别代表质量值≥20或30的碱基所占百分比。实验室应要求保证Q30至少达到85%［54］。在对测序数据进行分析之前，应首先进行质量控制，去除读长过短（如