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作者：

段晖

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摘要：

味觉是动物摄食行为的决定性因素,甜味作为味觉中最神秘的基本味觉形式,赋予动物食物营养信息。近几十年来甜味受体的发现及其功能的确定,为人类食品的开发、生产及人类健康提供了大量理论基础。但甜味识别机制的深入探索受到了甜味受体晶体结构缺失的严重限制。所以本研究在实验室前期研究基础之上,以带有人类甜味受体T1R2和T1R3基因的pcDNA3.1重组质粒为对象亚克隆了人类甜味受体基因胞外端,以此为基础构建甜味受体胞外端的真核表达载体pIRES-T1R2-T1R3,脂质体介导转染外源表达载体HEK293SGnTI-细胞,获得高效表达的人类甜味受体胞外端蛋白,并对其进行纯化和表达鉴定,以期在甜味识别的热力学及甜味受体结构等研究中获得更多信息。 研究内容及结果如下: (1)含有甜味受体胞外端基因的真核表达载体的构建 根据NCBI基因库中人类甜味受体基因T1R2/T1R3胞外段序列设计出特异性引物,以含全长hT1R2和hT1R3基因的pcDNATM3.1/Zeo(+)和pcDNATM3.1/Zeo(-)质粒为模板,通过RT-PCR扩增获得了目的基因,将其回收、纯化经酶切后与克隆载体pIRES连接,转化DH5α感受态细胞,在含氨苄青霉素的LB平板上筛选出阳性克隆质粒,挑取阳性克隆进行扩培,抽提后凝胶电泳验证其大小为9,000bp左右,与理论大小相一致;基因测序结果与NCBI中甜味受体胞外端基因比对匹配吻合,表明成功的构建了pIRES-T1R2-T1R3重组质粒。 (2)甜味受体蛋白表达及纯化 利用293-FreeTMTransfectionReagent试剂将重组质粒pIRES-T1R2-T1R3转染到覆盖率为60%~70%的HEK293SGnTI-细胞,收集转染48h后的HEK293SGnTI-细胞,提取总蛋白进行SDS-PAGE检测,目的蛋白成功表达,其条带大小为50kDa左右;Ni柱树脂对粗蛋白进行纯化,蛋白质电泳检测显示目的蛋白条带单一,表明纯化成功,测得其浓度为0.845mg/mL。 (3)表达结果的鉴定 分别采用免疫组织化学、等温量热滴定(ITC)、质谱和N-端测序的方法,对表达结果进行验证。细胞免疫结果显示:转染细胞与阳性对照组表达有甜味受体蛋白的人结肠癌细胞NCI-H716免疫效果一致,细胞膜上呈绿色荧光,表明重组质粒pIRES-T1R2-T1R3成功在HEK293SGnTI-细胞中表达,功能与天然的甜味受体几乎一致;与甜味剂葡萄糖的ITC滴定结果显示,试验组重组蛋白与对照组NCI-H716细胞一样都是放热的过程,但重组蛋白与葡萄糖的滴定曲线趋势变化显著,避免了众多因素的影响逐渐达到平衡,表明目的蛋白可以取代细胞作为甜味识别热力学研究的受体原料;N-端测序结果显示无氨基酸峰出现,表明目的蛋白N端封闭,所以无法利用Edman降解获得N-端氨基酸序列的信息;重组蛋白质谱结果显示:其分子量大小为50,529Da,与SDS-PAGE检测的50kDa结果一致;重组蛋白等电点为5.52,序列覆盖率为12%,通过蛋白数据库检索得到与其匹配的肽段分别是:SNMNMFESYINNLR,LEGLTDEINFLRQLYEEEIR,ASLEAIADAEQR和LALDIEIATYR,匹配的蛋白为人源甜味受体T1R2/T1T3,说明成功表达纯化出目的蛋白。 总之,本文在前期研究的基础上,采用多种实验手段,成功的构建了含甜味受体胞外端的真核表达载体,脂质体介导其在HEK293SGnTI-细胞中表达,Ni柱树脂纯化,并进一步通过免疫组化、ITC、质谱和N-端测序对表达结果进行验证,结果显示重组质粒成功表达,获得了纯度较高的甜味蛋白受体胞外端;在目前人们未能获得甜味蛋白精细结构之前,本研究结果对于甜味转导机制、甜味识别热力学机制和甜味蛋白功能研究具有一定的意义,同时也丰富了甜味受体体外表达方法。

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关键词：

甜味受体蛋白 GnTI-细胞 蛋白表达 等温微量热滴定 真核表达