昨夜雨疏风骤，

浓睡不消残酒。

试问卷帘人，

却道海棠依旧。

知否，知否？

应是绿肥红瘦。

李清照的这首《如梦令•昨夜雨疏风骤》不仅道出了女词人爱花惜花之情，也通过女词人之口委婉批评了卷帘侍女观察不仔细，回答不走心（图1）。事实上，科研工作也常常会遇到“昨夜雨疏风骤”的疑惑。此时，把握住实验现象的细节，走心地推理分析才能得到正确的结论。在天然产物研究中，有一个让科研工作者非常头疼的问题：提取分离到人工产物。天然来源的化合物，在生物培养和萃取纯化过程中，可能发生一些非酶促反应，产生了结构已经发生改变的非天然化合物。那么，对于天然产物研究者来说，最终分离得到的，是天然产物的“红”，还是人工产物的“绿”呢？可有经过一番严谨的实验设计推理“知否”过？

图1.如梦令•昨夜雨疏风骤。图片来源于网络

美国加州大学圣地亚哥分校Scripps海洋研究所的Chambers C. Hughes课题组（图2）就作了这样走心的研究，得出他们的天然产物其实是“绿肥红瘦”——绝大多数所谓的天然产物是人工产物。

图2. Chambers C. Hughes 助理教授（左）及课题组成员（右）。图片来源：Hughes Research Group[1]

他们首先对人工产物的概念进行了定义，指出人工产物在转化形成中不需要酶催化，是培养分离纯化中，通过生物和非生物试剂修饰的代谢产物。在多数情况下，人工产物容易在天然产物亲电位点与亲核试剂或溶剂反应中产生。如植物代谢产物Palmatine在分离过程中与溶剂反应形成假碱化合物2和人工产物3-5。5产生于含氢氧化铵和三氯甲烷的常规提取过程。用甲醇萃取海绵Hyrtios产生人工产物6、7。用水溶液萃取海绵Zyzzya，产生8、9。在分离纯化过程中，10会氧化成11。另一方面，含亲核位点的天然产物与亲电试剂反应产生人工产物比较少见，如在含有甲醛的生长介质中，二聚体13来自化合物12（图3）。

图3. 人工产物 2-5、7、9、11、13的形成 图片来源：J. Nat. Prod. [2]

Chambers C. Hughes课题组得到的人工产物就是少见的第二类。他们从一株海洋链霉菌CNR-698中分离到Ammosamides系列化合物，这是已知天然产物中，“唯二”拥有吡咯[4,3,2]喹啉骨架的。研究发现，Ammosamides系列的部分化合物有多样生物活性，如细胞毒活性、靶向肌球蛋白、抑制醌还原酶等。已有报道显示Ammosamide B（15）已经完成了化学全合成。另一方面，Chambers C. Hughes课题组一直在寻找具有亲电特性的天然产物，技术上他们使用硫醇探针19和三乙胺进行探索。

他们将硫醇探针19加入到链霉菌CNR-698萃取物中，产生一个单加合物20。由于硫醇探针上的溴原子也带入到20，凭借溴的同位素特征，通过高分辨质谱（HRMS）和核磁共振图谱（NMR）可以确定20的结构。通过反向合成分析，能判断出加合物20来源于Ammosamide C（16）。令他们奇怪的是，含有加合物20、探针19和三乙胺的混合物从红-紫色渐变为蓝色，经检测发现有Ammosamide A（14）和含溴化合物21形成。此前的细胞靶标研究发现，Ammosamide C（16）的亲电亚胺离子对于代谢物的生物活性很关键。但是16的细胞靶标和代谢机制还未阐明（图4）。

图4 . Ammosamide A（14）和含溴化合物21形成 图片来源：J. Nat. Prod. [2]

这些实验观察结果促使他们假设：Ammosamide C（16）是Ammosamides系列的前体。而这些Ammosamides系列化合物是人工产物，由非催化的、自发化学转化形成，是由于16上C-2位活跃的亚胺官能团亲电性引起的。

他们设计实验来验证这个假设。在一个关键性实验中，少量16加入A1培养基，缓冲液pH为10以模拟发酵培养基的碱度。5天后产生Ammosamide B（15）和E（18）。pH调到6.8，对转化影响甚微。而且16在碳酸氢钠水溶液中可以清晰转化为15，用半胱氨酸处理16并调节pH值为10，16转化为Ammosamide B（15）、E（18）和A（14）。虽然，以前也有人推测14和15来源于16，但这是第一次在实验条件下展示这个转化过程（图5）。当然，凡事不能绝对，Chambers C. Hughes并不否定酶存在催化这一系列化合物转化的可能性。

图5. Ammosamide A（14）、B（15）、C（16）、D（17）和E（18）的结构。图片来源：J. Nat. Prod. [1]

Ammosamide C（16）在这一系列转化中重要性不言而喻。但是这个代谢产物在菌株CNR-698中产量甚微，且具有亲水性，使得有机溶剂和疏水性树脂无法萃取。他们在纯化萃取上下了一番功夫，尤其是浓缩过程中酸化（加三氟乙酸）保护天然产物，大幅度减少了人工产物的生成。通过16 L培养物获得了100 mg目标产物16。

有了足够的Ammosamide C（16），他们继续设计实验，用不同的亲核试剂与之反应，以判断16的亚胺官能团反应活性，并获得足够数量的各种产物以便于进行完整的结构鉴定。用含胺的亲核试剂处理16产生了化合物23（n-丙胺和4-氯苯胺）和Ammosamide G（24），用含硫亲核试剂（n-乙酰半胱胺、乙硫醇和4-溴苯硫醇）处理16时，产生了化合物26-28，16转化为15只需提供最基本的水。他们假设这些转化都经过形成缩醛化合物22、25和29的过渡阶段，它们暴露在空气中被逐渐氧化。在惰性气体下进行反应时，可以看到清晰的颜色变化，伴随着两种缩醛的形成和随后的氧化（图6）。

图6. Ammosamide C（16）通过缩醛22、25、29过渡阶段形成一系列人工产物。图片来源：J. Nat. Prod. [2]

考虑到亲核试剂在自然界的存在具有广泛性，Chambers C. Hughes课题组认为：Ammosamides含有活跃的亚胺官能团可能代表一种策略。即能够使得Ammosamides骨架刻意多样化，进而产生能够显示多种生物学功能的一整类分子。随后，他们注意到Ammosamides B（15）在甲醇中长时间暴露于空气和阳光下，会转化为Ammosamides D（17）。这种转化现象在其它溶剂如四氢呋喃（THF）、二甲亚砜（DMSO）中未发现，表明这个转化需要质子化溶剂。这与先前的研究认为是酶催化产生化合物17形成了鲜明对比。

Chambers C. Hughes课题组对他们得到的所有Ammosamides进行了针对HCT-116结肠癌细胞的细胞毒活性测试。Ammosamide C（16）和其丙胺加成物23显示中等细胞毒活性，Ammosamide A（14）、B（15）、D（17）的细胞毒活性非常小。有趣的是，带有脂肪族胺、乙胺和异丙胺的Ammosamide L和M，对癌细胞HCC44显示显著的细胞毒活性。这些结果表明这类化合物针对真核细胞的细胞毒活性，可能与其代谢产物生态功能有联系。他们也对Ammosamide A-C进行了抗菌活性测试，测试菌株为两类海洋来源菌，结果显示化合物16对Bacillus菌株有显著抑制作用。化合物16对海洋革兰氏阳性菌株有显著作用可能反应了这类天然产物的真实生态功能。

总结

（1）含有亲电位点的天然产物较少见，但是其生物活性好，结构多样化程度高，所以Chambers C. Hughes课题组一直致力于用他们设计的含硫探针和三乙胺去寻找这类化合物，所谓“工欲善其事，必先利其器”。

（2）在研究分离自海洋链霉菌CNR-698的Ammosamides类化合物时，他们走心的发现探针19加入Ammosamide C（16）时，红-紫标记的混合物逐渐变蓝，期待的“红”-加成物20出现了，还意外出现了“绿”-Ammosamide A（14），且这个转化过程不需要催化完全自发进行。

（3）于是，他们设计实验模拟微生物发酵培养下的条件，发现Ammosamide C（16）在弱碱或弱酸条件下，能自发转化为-Ammosamide A（14）、B（15）和E（18），说明14、15和18是人工产物。

（4）为了模拟自然条件下存在的多种亲核试剂对Ammosamides的影响，在获得足够量Ammosamide C（16）的基础上，他们用含硫、含胺亲核试剂和水分别处理16，含胺试剂处理16产生了化合物23和Ammosamide G（24），含硫试剂处理产生化合物26-28，15则只需水就可以从16转化过来。他们还发现15在甲醇中长时间暴露于阳光和空气，会转化为Ammosamide D（17）。这样一来，除了16，其余全是自发转化产生的人工产物，实验结果呈现“绿肥红瘦”的景象。

（5）最后，他们还测试了这类化合物的细胞毒活性和抗菌活性，推测这类化合物含有活跃的亚胺官能团，在自然条件下结构自发多样化，可能代表了一种自然策略，可以显示多种生物活性或生态功能（图7）。

图7. Ammosamides 系列人工产物的形成 图片来源：J. Nat. Prod. [2]

参考资料：

1.http://hughes.ucsd.edu/

2. Thiol-Based Probe for Electrophilic Natural Products Reveals That Most of the Ammosamides Are Artifacts, J. Nat. Prod., 2017, 80, 126-133, DOI: 10.1021/acs.jnatprod.6b00773

导师信息：http://scrippsscholars.ucsd.edu/chughes/

（本文由水村山郭供稿）

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