一种检测人类疱疹病毒

您所在的位置:网站首页 玫瑰疹病毒属人类疱疹病毒7型 一种检测人类疱疹病毒

一种检测人类疱疹病毒

2024-07-13 07:13| 来源: 网络整理| 查看: 265

1.一种检测人类疱疹病毒-7(HHV-7)的RCA方法,其特征在于,按照如下步骤完成:(1)将待测标本按Qiagen公司的病毒DNA提取试剂盒步骤处理,获得含人类疱疹病毒-7(HHV-7)的基因组DNA样品;(2)捕获探针的杂交:在反应管中依次加入含人类疱疹病毒-7(HHV-7)的基因组DNA样品、锁式探针、捕获探针,充分混匀,55±1℃水浴杂交,杂交完成后自然冷却至室温,加入溶于2×结合缓冲液的链霉亲和素包被的磁珠,混匀,室温放置,磁性分离,用1×结合缓冲液清洗磁珠数次,弃去洗液,得到杂交产物;(3)锁式探针的环化连接与酶切:去离子水、步骤(2)制得的杂交产物和10×E.coli Buffer,轻轻混匀,在95±1℃下反应3-5min,然后再在45±1℃下孵育后,加入10×BSA缓冲液和E.coli DNA连接酶,混匀,在37±1℃进行环化连接反应;反应完成后加入10×Exonuclease Ⅰ Buffer和ExonucleaseⅠ核酸外切酶,混匀,在37±1℃反应,反应完成后在95±1℃下条件下灭活Exonuclease Ⅰ核酸外切酶,得到探针环化连接产物;(4)RCA扩增:取步骤(3)中制得的探针环化连接产物、加入引物和10×phi29 Buffer,混匀后在95±1℃下反应3-5min,然后进行冰浴;再加入phi29DNA聚合酶、dNTPs液,混匀后在37±1℃进行RCA反应,得到扩增产物;(5)取步骤(4)制得的扩增产物用的琼脂糖凝胶电泳,有肉眼可见条带扩增出来的为人类疱疹病毒-7(HHV-7)阳性,反之为人类疱疹病毒-7(HHV-7)阴性,即可完成对人类疱疹病毒-7(HHV-7)的检测;所述步骤(4)中所设计用于RCA反应的引物是:5’-CAGATCTGCCACCTTATCCTTAATCTGCCA-3’ SEQ NO1;所述步骤(2)中的锁式探针为:5’-CACGAATAATCTCGAACTCACTAGACCACCGGTGACAACAGATAATGTCTGTATCTGCTAACCAAGAGCAACTACACGCACAGAGAAGACAACCTACAGACACCGTCC-3’探针的5’端进行磷酸化修饰SEQ NO2;所述步骤(2)中的捕获探针为:Biotin-CAGATCTGCCACCTTATCCACCAGTAGCAGTCATGCAGAACCTAGAGGAGASEQ NO3。2.根据权利要求1所述的检测人类疱疹病毒-7(HHV-7)的RCA方法,其特征在于,步骤(2)中锁式探针、捕获探针的浓度均为0.5-1.5μmol/L,且锁式探针、捕获探针相对于DNA样品体积的10-20%。3.根据权利要求1所述的检测人类疱疹病毒-7(HHV-7)的RCA方法,其特征在于,步骤(3)中10×E.coli Buffer相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的18-25%;10×BSA缓冲液相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的18-25%;E.coli DNA连接酶相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的1.5-2.5%;10×Exonuclease I Buffer相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的18-25%;Exonuclease I相对于步骤(2)制得的杂交产物体积的18-25%。4.根据权利要求1所述的检测人类疱疹病毒-7(HHV-7)的RCA方法,其特征在于,步骤(4)中引物的添加量为探针环化连接产物的1.8-3%;10×phi29 Buffer的添加量为探针环化连接产物的9.5-15%;phi29 DNA聚合酶的添加量为探针环化连接产物的1.8-3%。



【本文地址】


今日新闻


推荐新闻


CopyRight 2018-2019 办公设备维修网 版权所有 豫ICP备15022753号-3