1 材料

1.1动物与细胞

SPF级SD雄性大鼠，体质量180～220 g，由江西中医药大学动物实验科技中心提供，许可证号SYXK（赣）2020-0003。大鼠饲养于12 h光照/12 h黑暗交替的环境中，室温20～25 ℃，相对湿度为40%～60%，自由饮水与进食。动物实验经江西中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号JZSYDWLL-20201215）。

HuTu-80细胞购自上海富衡生物科技有限公司。

1.2药材

玉竹购自安徽道源堂中药饮片有限公司，附子、肉桂、干姜购自江西吁江生态科技有限公司，经江西中医药大学付小梅教授鉴定分别为百合科植物玉竹P.odoratum(Mill.) Druce的干燥根茎、毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeliiDebx.的子根、樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl的干燥树皮以及姜科植物姜Zingiber officinaleRosc.的干燥根茎。

1.3药品与试剂

GLP-1、MTL、CCK、VIP试剂盒（批号20201019）购自上海恒远生物科技有限公司；RNA提取试剂盒（批号R1200）购自北京索莱宝科技有限公司；M5 Sprint qPCR RT kit with gDNA remover（批号MF949-01）、Realtime PCR Super mix SYBR green with anti-Taq（批号MF013-01）购自北京聚合美生物科技有限公司；Na + , K + -ATP 酶试剂盒（批号A070-2-2）、Ca 2+ , Mg 2+ -ATP 酶试剂盒（批号A070-3-2）购自南京建成生物工程研究所；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；AQP1抗体（批号ET1703-34）、AQP3抗体（批号HA500247）、β-actin抗体（批号EM21002）、二抗（批号HA1006）购自杭州华安生物技术有限公司；T1R2抗体（批号Ab-DF10279）购自Affinity Biosciences公司；T1R3抗体（批号A10157）购自武汉爱博泰克生物科技有限公司；α-gustducin抗体（批号bs-6149R）购自北京博奥森生物科技有限公司。

1.4仪器

Multiskan GO全波长酶标仪（美国Thermo公司）；Light Cycler 96型qRT-PCR仪（罗氏集团）；Chemidoc XRS+高灵敏度化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）；752型紫外-可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；MC-347型欧姆龙电子体温计（欧姆龙大连有限公司）；Allegra 64R型高速冷冻离心机（美国贝克曼库尔特公司）；DYCZ-24DN型双垂直电泳仪（北京六一仪器厂）。

2 方法

2.1药物的制备

取玉竹，加水浸泡1.0 h后，加热至100 ℃，回流提取2次，同时收集挥发油，备用（得率0.98%）；合并提取液，浓缩，加乙醇至含醇80%，冷藏，过滤，沉淀干燥，即得玉竹“多糖”，质量分数为73.25%，得率21.19%，且符合《中国药典》2020年版要求[14]；滤液浓缩，干燥，粉碎，与上述挥发油混合均匀，即得玉竹“醇提取物”，得率12.30%，其中含总黄酮2.93%、总皂苷6.50%；合并玉竹“多糖”与玉竹“醇提取物”，即得玉竹“总提取物”。

取附子适量，加水100 ℃提取60 min后，再加入干姜、肉桂提取，滤过，药渣再提取1次，合并2次滤液，浓缩至生药质量浓度2 g/mL，即得“热性中药”提取液，4 ℃储存，备用。

2.2基于整体动物模型阐释玉竹“补而不腻”机制

2.2.1动物造模、分组及给药取大鼠50只，ig热性中药（10 mL/kg）制备阴虚证模型，以体质量、活动状态、毛发光泽、爪色、尿液颜色、粪便质地为模型评价指标[15]。造模成功后随机分为模型组、多糖（267 mg/kg，根据临床剂量及浸膏得率换算，下同）组、醇提取物（155 mg/kg）组和总提取物组（422 mg/kg）组，每组10只；另取10只大鼠作为正常组，正常组及模型组ig等体积的0.9%生理盐水，1次/d，连续28 d。

2.2.2体质量、体温、摄食量、摄水量、粪便含水率、皮肤含水率的检测参照文献方法[16]，分别于给药前及给药后7、14、21、28 d进行体质量、体温、摄食量、摄水量测定。同天收集大鼠24 h的粪便，称定，记为湿质量，然后在90 ℃的烘箱中烘干3 h，称定，记为干质量，计算粪便含水率[17]；取皮肤约1 cm 2 ，称定质量，记为湿质量，随即放入80 ℃烘箱中干燥2 h，称定质量，记为干质量，计算皮肤含水率[18]。

粪便含水率＝(湿质量－干质量)/湿质量

皮肤含水率＝(湿质量－干质量)/湿质量

2.2.3胃排空率与小肠推进率的测定末次给药后，禁食不禁水12 h，ig酚红溶液，30 min后ip戊巴比妥钠麻醉，取胃并切开，以蒸馏水冲出内容物并收集，定容，加NaOH溶液混匀，室温放置后取 上清液加入20%三氯乙酸溶液，离心后取上清液测定其吸光度（A）值，记为A实测酚红；另取0.04%酚红-明胶溶液，按上述方法，依次加蒸馏水、NaOH、三氯乙酸溶液，混匀配成标准溶液，测定A值，记为A标准酚红，计算胃排空率[19]。同时分离小肠，直铺于冰上，量取小肠全长及酚红在小肠内的推进的距离，计算小肠推进率[20]。

胃排空率＝1－A实测酚红/ A 标准酚红

小肠推进率＝幽门至酚红染成红色末端的距离/幽门至回盲瓣的距离

2.2.4取样在完成“2.2.3”项下实验后，取皮肤、肺、肝、胃、肾、十二指肠，放入−80 ℃超低温冰箱，备用；另腹主动脉取血，静置，离心，取上清，得血清，备用，同时收集下层红细胞，备用。

2.2.5GLP-1、CCK、MTL、VIP含量的测定取血清，按试剂盒说明书，采用ELISA法测定血清中GLP-1、CCK、MTL、VIP的含量。

2.2.6Na + , K + -ATP 酶、Ca 2+ , Mg 2+ -ATP 酶活性测定取肝、肾组织适量，按1∶9加生理盐水，匀浆，4 ℃离心，取上清测定酶的活性；取红细胞于离心管，加PBS及PMSF，置冰上破溶，离心，得红细胞膜，备用；取细胞膜，加裂解液，反复冻融3次，离心，取上清测定酶的活性。

2.2.7qRT-PCR测定AQP1、AQP3、T1R2、T1R3和α-gustducinmRNA表达取肺、胃、肾、十二指肠适量，按照试剂盒说明书提取总RNA并合成cDNA，进行qRT-PCR分析。引物序列见表1。

2.2.8Western blotting测定AQP1、AQP3、T1R2、T1R3和α-gustducin蛋白表达取肺、胃、肾、十二指肠适量，匀浆，加裂解液提取蛋白，测定蛋白浓度，蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF膜，封闭，加入一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜，加入二抗孵育，洗涤，显色。

2.3基于细胞模型阐释玉竹“补而不腻”机制

2.3.1 Na + , K + -ATP 酶、Ca 2+ , Mg 2+ -ATP 酶活性测定取对数生长期的HuTu-80细胞，以4×10 5个/孔接种于6孔板，贴壁后吸去培养基，设置正常组、多糖（200 μg/mL）组、醇提取物（100 μg/mL）组和总提取物（300 μg/mL）组，正常组加入细胞培养液2 mL，给药组加入同体积的相应提取液，继续培养24 h后，消化后离心收集细胞，加缓冲液，匀浆破碎细胞，测定Na +, K +-ATP 酶、Ca 2+, Mg 2+-ATP 酶的活性。

2.3.2GLP-1含量的测定按“2.3.1”项下进行分组和给药，培养24 h后吸去培养基，再加入3 mmol/L葡萄糖，孵育5 min，小心吸取细胞培养液于EP管内，4 ℃离心10 min，取上清测定GLP-1含量。

2.3.3qRT-PCR和Western blotting测定AQP1、AQP3、T1R2、T1R3mRNA和蛋白表达按“2.3.1”项下进行分组和给药，培养24 h后吸去培养基，按“2.2.7”项下方法测定细胞中AQP1、AQP3、T1R2、T1R3mRNA表达，按“2.2.8”项下方法测定细胞中AQP1、AQP3、T1R2、T1R3蛋白表达。

2.4统计学分析

采用SPSS 19.0软件处理数据，以表示，组间均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间均数的两两比较采用最小显著差数（LSD）法。

3 结果

3.1 玉竹对阴虚大鼠体质量、体温、摄食量、摄水量、粪便含水率和皮肤含水率的影响

如图1-A所示，“阴虚”会导致大鼠体质量下降（P＜0.05）；与模型组比较，给予玉竹多糖、总提取物干预14 d后，大鼠体质量明显增加（P＜0.05），而“阴虚”动物的体温并未见明显升高（图1-B）。 如图1-C所示，“阴虚”会导致动物的摄水量增加（P＜0.05），而玉竹醇溶性成分则“顺应”这种规律，给予醇提取物干预7、14 d，大鼠的摄水量进一步增加（P＜0.05），这可能与醇溶性提取物中含有挥发油有关[21]；然而给予玉竹多糖14 d后，摄水量显著下降（P＜0.05）。如图1-D所示，多糖组大鼠在给药前期（7、14 d）摄食量显著上升（P＜0.05），而给药21 d后呈下降趋势，给药28 d摄食量明显下降（P＜0.05）；这一结果表明，玉竹多糖可能对阴虚动物具有“治疗”作用而出现摄食量增加，但久服多糖可能出现了“滋腻碍胃”效应，降低了大鼠的食欲而致摄食量下降。如图1-E所示，与模型组比较，给予玉竹多糖、总提取物组21 d后，大鼠粪便含水率明显上升（P＜0.05）；如图1-F所示，与模型组比较，多糖组、总提取物组大鼠皮肤含水率显著升高（P＜0.05）。

3.2 玉竹对阴虚大鼠胃排空率、小肠推进率和胃肠激素的影响

如图2-A所示，与正常组比较，模型组大鼠胃排空率、小肠推进率显著上升（P＜0.05）；与模型组比较，多糖组大鼠胃排空率和小肠推进率明显减慢（P＜0.05）；与多糖组比较，总提取物组大鼠胃排空率和小肠推进率显著增加（P＜0.05）。如图2-B所示，与正常组比较，模型组大鼠血清中GLP-1、CCK和VIP含量明显降低（P＜0.05），MTL含量显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，多糖组大鼠GLP-1、CCK和VIP含量明显上升（P＜0.05），MTL含量显著下降（P＜0.05）；醇提取物组大鼠GLP-1含量进一步降低（P＜0.05），MTL含量却进一步明显升高（P＜0.05）；与多糖组比较，总提取物组大鼠GLP-1含量明显下降（P＜0.05）。

3.3 玉竹对阴虚大鼠肝、肾、红细胞膜中Na + , K + -ATP 酶和Ca 2+ , Mg 2+ -ATP 酶活性的影响

如图3-A所示，与正常组比较，模型组大鼠肝、肾组织中Na +, K +-ATP 酶活性明显上升（P＜0.05）；与模型组比较，多糖组、总提取物组大鼠肝、肾组织中Na +, K +-ATP 酶明显下降（P＜0.05）；与多糖组比较，总提取物组大鼠肝组织中Na +, K +-ATP 酶明显上升（P＜0.05）。如图3-B所示，与正常组比较，模型组大鼠肝、肾、红细胞膜中Ca 2+, Mg 2+-ATP 酶活性明显上升（P＜0.05）；与模型组比较，多糖组肝组织中Ca 2+, Mg 2+-ATP 酶活力明显下降（P＜0.05），而醇提取物组大鼠肝、肾、红细胞膜中Ca 2+, Mg 2+-ATP 酶活性进一步上升（P＜0.05）。

3.4玉竹对阴虚大鼠肺、胃、肾组织中AQP1、AQP3mRNA和蛋白表达的影响

如图4-A、D所示，与正常组比较，模型组大鼠肺、胃、肾中AQP1、AQP3mRNA表达水平均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，多糖组肺、肾中AQP1、AQP3mRNA表达水平明显上升（P＜0.05），醇提取物组胃AQP3mRNA表达水平却显著下降（P＜0.05）；与多糖组比较，总提取物组大鼠肺、胃中AQP1mRNA表达水平显著下降（P＜0.05）。如图4-B、C、E、F所示，与模型组比较，多糖组肺、胃、肾AQP1、AQP3蛋白表达水平均明显上升（P＜0.05），总提取物组肾AQP1、AQP3蛋白表达水平明显上升（P＜0.05）；与多糖组比较，总提取物组肺、胃中AQP1、AQP3蛋白表达水平明显下降（P＜0.05）。

3.5 玉竹对阴虚大鼠十二指肠组织中T1R2、T1R3、α-gustducinmRNA和蛋白表达的影响

如图5-A所示，与正常组比较，模型组大鼠T1R2、T1R3和α-gustducinmRNA表达均显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，多糖组大鼠T1R2、T1R3、α-gustducinmRNA表达均明显升高（P＜0.05），而醇提取物组T1R3mRNA的表达则“顺应”阴虚动物的变化规律，表达进一步下降（P＜0.05）；与多糖组比较，总提取物组T1R3mRNA表达明显下降（P＜0.05）。如图5-B、C所示，与正常组比较，模型组T1R2、T1R3、α-gustducin蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，多糖组T1R2、T1R3、α-gustducin蛋白表达明显升高（P＜0.05），醇提取物组T1R3表达进一步下降（P＜0.05）；与多糖组比较，总提取物组T1R3蛋白表达明显下降（P＜0.05）。

3.6玉竹对HuTu-80细胞中Na + , K + -ATP 酶、Ca 2+ , Mg 2+ -ATP 酶、GLP-1、AQP1、AQP3、T1R2、T1R3的影响

如图6-A所示，与正常组比较，多糖组Na +, K +-ATP 酶、Ca 2+, Mg 2+-ATP 酶活性明显下降（P＜0.05）。图6-B显示，多糖可明显促进GLP-1的分泌（P＜0.05），而醇提取物则可显著抑制GLP-1分泌（P＜0.05）；与多糖组比较，总提取物组GLP-1含量明显下降（P＜0.05）。如图6-C所示，与正常组比较，多糖组AQP1、AQP3、T1R2mRNA表达水平明显上升（P＜0.05），而醇提取物组AQP3、T1R3mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）；与多糖组比较，总提取物组AQP3mRNA表达水平明显降低（P＜0.05）。如图6-D、E所示，与正常组比较，多糖组AQP1、T1R2蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），醇提取物组T1R2、T1R3蛋白表达水平则明显下降（P＜0.05）；与多糖组比较，总提取物组T1R2蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。

4 讨论

补阴药味“甘”，既具“滋补”之效，又有“滋腻”之弊，正如《医学源流论》所云：“补益滋腻之药”。《中医诊断学》认为，阴虚证是指人体阴液亏少，其滋润、濡养功能减退，或阴不制阳，阳气偏亢，以口咽干燥、五心烦热、潮热盗汗为主要表现的虚热证[22]。因此，补阴的“滋补”效应可看作是补阴药对阴液亏少、潮热盗汗等“症状”的缓解作用。本研究将“阴虚”动物的体质量、体温、摄食量、摄水量、粪便含水率、皮肤含水率、胃排空率、 小肠推进率、Na +, K +-ATP 酶、Ca 2+, Mg 2+-ATP 酶、GLP-1、CCK、MTL、VIP、AQP1、AQP3、T1R2、T1R3、α-gustducin作为“阴虚指标”。在这些指标中，体质量等15个指标与阴虚均有直接联系[3,23-24]， 而GLP-1、T1R2、T1R3、α-gustducin 4个指标与阴虚的直接关联，还有待进一步挖掘；但研究发现GLP-1、T1R2、T1R3、α-gustducin等指标与糖尿病有关联[9,25]，而糖尿病常有“阴虚”表现。在确定“阴虚指标”的基础上，将补阴药对阴虚模型动物阴虚指标的“逆转”作用确定为“滋补”作用，如“逆转”超出一定程度，即为“滋腻”作用。因此，“滋腻”不只是与胃肠蠕动减慢有关，还与其他因素有关，如AQP蛋白的表达超出一定范围，水湿停滞，也易“滋腻”。

动物模型的合理性、可重复性是中医药研究科学性、可靠性的重要保障。目前“阴虚证”动物模型的构建主要包括“模拟阴虚证临床表现、模拟阴虚证病因病机、模拟阴虚临床高发病”3种方法[26]。采用甲状腺素激素构建阴虚证即属于“模拟阴虚证临床表现”的造模方法，而采用四氯化碳导致肝炎进而出现“阴虚”，即属于“模拟阴虚临床高发病”的造模方法。本研究采用热性中药制备阴虚模型，属于“模拟阴虚证病因病机”的造模方法。《素问·阴阳应象大论》云：“阳盛则阴病”，且玉竹是典型的补阴药，主要用于胃阴虚、肺阴虚，因此ig热性中药，易导致“胃阴虚”。实验中发现，大鼠长期ig热性中药后“阴虚”症状明显，无死亡现象，重复性较好。需要指出的是，ig热性中药可能是“实热”，也可能是“阴虚（内热）”。本研究发现，造模前期，大鼠出现烦躁、易怒等“实热”症状，但“久服”热性中药后，大鼠摄水量增加，皮肤干燥，而体温却未见明显变化，表明出现了“阴虚（内热）”。

甜味受体分布广泛，激动肠道甜味受体可促进肠道L细胞分泌GLP-1。GLP-1不仅可促进胰岛素分泌，还能抑制食欲减缓胃排空[27]。因此，GLP-1体现了“滋补”、“滋腻”2种相反效应。本研究中，阴虚大鼠GLP-1的分泌下降，胃肠道蠕动能力增强，这也与胃排空与小肠推进率实验结果一致；给予玉竹多糖干预后，GLP-1分泌明显增加，而与多糖组比较，总提取物组大鼠GLP-1明显下降。从GLP-1的效应分析，服用玉竹多糖后GLP-1的分泌量明显增加，在发挥“滋补”作用的同时，也必然出现胃肠蠕动减慢等“滋腻”效应；服用由多糖、醇提取物组成的玉竹总提取物，其中的多糖促进GLP-1的分泌，而其中的醇提取物则抑制GLP-1的分泌。这可能是玉竹治疗阴虚证“补而不腻”的主要机制。同时，本研究还发现，阴虚会导致T1R2、T1R3的表达降低，玉竹多糖、玉竹醇提取物对T1R2、T1R3的表达均有作用，但作用相反；在细胞实验中T1R2、T1R3的表达也有相似的规律。可见，玉竹醇提取物可部分抵消玉竹多糖对甜味受体表达的作用，这可能是玉竹“补而不腻”主要物质基础。

课题组前期研究玉竹多糖对糖尿病大鼠甜味受体的影响，结果显示，玉竹多糖对甜味受体T1R2、T1R3的表达有促进作用[28]；结合本实验结果推测，玉竹多糖可能通过上调甜味受体的表达，并在内源性甜味剂——葡萄糖的参与下，促进GLP-1的分泌；换句话说，玉竹多糖可能是甜味受体的诱导剂，而非激动剂，因此本实验未考察玉竹多糖与甜味受体激动剂/抑制剂合用后的效应；与玉竹多糖不同，玉竹醇提取物中含有的物质可能是甜味受体抑制剂，能下调甜味受体的表达；还可能既是抑制剂又是拮抗剂，在下调甜味受体表达的同时还能阻断激动剂与之结合。课题组已从玉竹醇提取物中分离纯化了“玉竹皂苷”（质量分数为63.5%），并考察了玉竹皂苷单用及与甜味受体抑制剂Lactisole合用时对GLP-1分泌的影响；接下来，将进一步研究“玉竹醇提取物”中另一种成分——玉竹黄酮对甜味受体及GLP-1的作用。

研究表明，甜味受体与AQP、Na +, K +-ATP 酶、Ca 2+, Mg 2+-ATP 酶存在关联，AQP的功能主要是是介导水的转运[29]。研究发现，皮肤中的AQP3表达与阴虚皮肤干燥存在一定联系[30]；本实验中，阴虚大鼠肺、胃、肾中AQP1、AQP3表达降低，给予多糖后，AQP1、AQP3表达升高，而给予醇提取物后，胃、肾AQP3的表达在模型组的基础上进一步降低；细胞实验中的玉竹多糖、醇提取物对AQP1、AQP3表达也呈现与整体动物相似的规律。研究还发现，甲状腺功能亢进、糖尿病等“阴虚”证Ca 2+, Mg 2+-ATP 酶的活性也会发生相应改变[31]。本研究中，与模型组比较，多糖组大鼠肝Ca 2+, Mg 2+-ATP 酶活力明显下降，醇提取物组大鼠肝、肾、红细胞膜Ca 2+, Mg 2+-ATP 酶活力明显上升。本实验结果表明，玉竹多糖与玉竹醇溶性成分对Ca 2+, Mg 2+-ATP 酶活力的影响也可能存在“相反”效应，即玉竹醇溶性成分可在一定程度上“抵消”了玉竹多糖对Ca 2+, Mg 2+-ATP 酶活性的“抑制效应”。以上研究表明，玉竹多糖、玉竹醇溶性成分对AQP、Ca 2+, Mg 2+-ATP 酶的作用的方向“相反”，这可能也是玉竹“补而不腻”的机制之一。

进一步分析发现，玉竹对GLP-1、T1R2、T1R3、AQP、Ca 2+, Mg 2+-ATP 酶等阴虚指标具有“双向调节”作用；事实上，玉竹“既能滋阴又能增长阳气”[32]，这就是玉竹的“双向调节”作用的中医表述。双向调节是指当机体处于失衡状态时，采用同一药物或方剂治疗后，既能使机体从亢进状态向正常状态转化，亦可使机体从低下状态向正常状态转化[33]。需要注意的是，机体从“失衡状态”到“正常状态”的转变，也可能是基于机体的“自然恢复性”。本文结果表明，模型组与给药组的阴虚指标在 “数值 ”上存在较大的差别。因此推断，玉竹对GLP-1、T1R2、T1R3、AQP、Ca 2+, Mg 2+-ATP 酶等阴虚指标具有“双向调节”作用，其机制可能与玉竹同时含有多糖、醇提取物等“多成分”有关。

综上，玉竹多糖通过上调甜味受体的表达，促进GLP-1分泌，“逆转”了AQP、Na +, K +-ATP 酶等阴虚指标，从而发挥“滋补-滋腻”正反效应，而醇提取物则部分抵消多糖对GLP-1、T1R2、T1R3、AQP、Ca 2+, Mg 2+-ATP 酶等指标的逆转效应，故玉竹总体上呈现“补而不腻”。由于目前尚无公认的用于治疗阴虚证的药物，且基于“甜味受体”治疗阴虚证的药物缺乏，本研究未设置阳性对照组。本研究从“成分”出发，分析比较玉竹中各成分对“阴虚指标”的作用方向及作用强度，从“甜味受体”一个角度，同时阐明玉竹“滋补-滋腻-不腻”，即“补而不腻”的作用机制，为玉竹、补阴药、甘味药的功效阐释提供新思路，丰富并助推了五味理论的传承与发展。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略）

来 源：欧阳征海，吴 璐，李 婷，邓碧莲，肖 音，杨华生．从甜味受体的角度探讨玉竹治疗阴虚证“补而不腻”作用机制 [J]. 中草药, 2023, 54(10):3179-3188.返回搜狐，查看更多