中国灵芝Ganoderma lingzhi S.H. Wu, Y. Cao & Y.C. Dai，原学名Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst.[1]，为名贵药用担子菌，具有抑制肿瘤生长[2]、保护肝脏[3]和抗人类免疫缺陷病毒[4]等药理功能。近年来，国内外学者对灵芝的化学成分、药理作用及临床效果等进行了研究，目前已从灵芝中分离得到160多种化合物，其中三萜类化合物(特别是灵芝酸Ganoderic acid，GA) 具有显著的药理作用，是灵芝的关键药理活性物质，也是决定灵芝药效高低的重要指标[5-6]。

目前，通过控制发酵策略[7-8]、添加化学诱导剂[9-10]和基因工程[11-12]等方法，提高灵芝中GA产量的相关研究已取得了一定进展。灵芝三萜合成的分子调控机制领域也取得了一些成果，初步阐明了活性氧[13]、钙离子[14]、cAMP[15]和磷脂信号[16-17]在三萜生物合成中的作用。然而，这些已知信号分子的下游通路(位点/靶点) 对于三萜生物合成的调控机制仍知之甚少。

磷脂酸(Phosphatidic acid，PA) 是生物细胞内天然存在的最简单的甘油磷脂，也是细胞膜的一个次要组成部分，由于其具有多种生物功能而受到越来越多的关注。例如，作为合成所有膜甘油磷脂的关键中间代谢物，PA有助于细胞膜的形成，从而在活细胞中发挥重要的膜结构基础作用[18]。此外，PA还被认为是一类脂质信号分子，通过与蛋白质结合，包括转录因子、蛋白激酶、脂类激酶、蛋白磷酸酶等，参与各种植物过程[19]。例如，磷脂酶D (Phospholipase D，PLD) 介导产生的PA可与组成型三重反应蛋白(Constitutive triple response，CTR) 相互作用，参与缺氧胁迫条件下的植物乙烯信号转导[20-21]。PA与植物两个生物钟(昼夜节律) 相关蛋白(Late elongated hypocotyl，LHY；circadian clock associated，CCA)相互作用并调节其功能，以调节植物昼夜节律生物钟[22]。然而，在微生物中，对PA的生物调节功能的研究却很少，PA互作蛋白的研究也完全不清楚。

我们先前的研究发现PLD介导产生的PA信号在灵芝三萜生物合成中发挥关键调控作用[17]，为进一步阐明PA调控灵芝三萜合成的分子机制，本研究采用PA-beads富集灵芝细胞PA互作蛋白，结合LC-MS/MS技术，鉴定灵芝细胞中PA互作蛋白，进一步利用GST-pull down进行免疫学验证，为后续深入研究PA调控灵芝三萜生物合成的分子机制奠定基础，也为其他物种的PA信号通路相关研究提供借鉴。

供试灵芝菌株为SCIM 1005 (Strain Collection of Industrial Microorganisms)；

培养基(g/L)：葡萄糖(44.0)、玉米粉(0.5)、蛋白胨(6.5)、磷酸二氢钾(0.75)，MgSO4·7H2O (0.45) 和维生素B1 (0.01)。

蛋白提取液：10 mmol/L HEPES-KOH (pH 7.9)，1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl。

PA-beads：购自Echelon Biosciences公司，P-B0PA。

洗涤缓冲液：10 mmol/L HEPES-KOH (pH 7.4)，150 mmol/L NaCl，0.25% Igepal。

2× Laemmli sample buffer：4% SDS、20%甘油、10% 2-巯基乙醇、0.004%溴酚蓝和0.125 mol/L Tris-HCl (pH 6.8) (Sigma，S3401)。

灵芝菌丝在液体培养基中，27 ℃、160 r/min黑暗培养7 d，过滤收集菌丝体(设置3个重复)，预冷PBS清洗2遍。

菌丝体样品进行液氮研磨，使用蛋白提取液提取灵芝总蛋白，总蛋白液用Bradford法进行定量后，进行PA互作蛋白富集。

取10 μg蛋白用Washing buffer稀释，加入100 μL PA-beads试剂，蛋白与PA-beads置于4 ℃摇床温和孵育3 h。离心去上清，加入10倍体积洗涤缓冲液清洗PA-beads三遍。加入等体积的2× Laemmli sample buffer，95 ℃反应10 min洗脱PA互作蛋白，离心取上清蛋白液用于后续分析。

上述蛋白样品进行SDS-PAGE分离，将SDS-PAGE中的蛋白条带进行切割，切割条带用蛋白胶回收试剂盒进行蛋白回收纯化，蛋白经过酶解后，进行Q Exactive-HF质谱仪上机检测，ProteomeDiscover 2.4软件进行检索，鉴定结果比对数据库为已发表的灵芝基因组翻译而来的蛋白序列[23]，实验简要流程如下所示：

利用Trizol试剂提取灵芝RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板，利用含有同源臂及酶切位点的引物(表 1) 扩增得到基因片段(基因序列见《生物工程学报》网络版附件1)，利用SoSoo重组克隆试剂盒(北京擎科生物科技有限公司) 将cDNA片段重组到pGEX 4T-1载体(GST-tag)，热激转化到大肠杆菌Escherichia coli BL21菌株，筛选阳性克隆进行测序。

将测序正确的BL21菌株接种于液体LB培养基中，摇床培养(37 ℃、200 r/min) 至OD600为0.55–0.6之间，取1 mL菌液作为对照，在剩余的菌液中加入1 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG) 于20 ℃摇床200 r/min培养12 h诱导表达。采用GST融合蛋白纯化磁珠(苏州英芮诚生化科技) 进行蛋白纯化，纯化步骤按照说明书进行，纯化获得的蛋白进行SDS-PAGE检测。

将纯化获得的蛋白液与PA-beads孵育洗脱(方法同1.2.3)，获得的蛋白液进行Western blotting分析(未与PA-Beads孵育的蛋白样品为input阳性对照，GST标签蛋白为阴性对照)：采用SDS-PAGE分离蛋白样品，利用电转膜仪(恒流250 mA，2 h) 将PAGE胶中的蛋白转移到聚偏二氧乙烯(Polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上；使用5%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜1 h后，加入GST一抗(Engibody)，室温条件下摇床摇动1 h，然后4 ℃过夜；采用PBST洗膜3次(10 min/次)，加入HRP二抗(Engibody)，孵育1 h；之后PBST缓冲液洗膜2次，PBS缓冲液洗膜一次(10 min/次)；最后将PVDF膜置于成像系统进行显色分析。

经质谱鉴定并与灵芝基因组数据库比对，共获得19个PA互作蛋白，进一步利用NCBI BLAST分析PA互作蛋白的功能，所得结果如表 2所示。检测出的灵芝蛋白主要有细胞色素P450单加氧酶、特异性蛋白激酶(丝裂原激活蛋白激酶)、过氧化氢酶、细胞表面疏水性蛋白、磷脂酸胞苷酰转移酶、转录延伸因子、rRNA加工蛋白和核糖体蛋白等(鉴定到的蛋白氨基酸序列见《生物工程学报》网络版附件2)。

为了验证质谱鉴定到的灵芝PA互作蛋白，我们选择细胞色素P450单加氧酶(GL22084) 和丝裂原活化蛋白激酶MAPK (GL23765) 进行免疫学GST-pull down验证。通过诱导表达和SDS-PAGE分析(图 1A)，GL23765和GL22084蛋白成功诱导表达；利用GST融合蛋白纯化磁珠纯化和SDS-PAGE分析，获得了纯化的GL23765和GL22084蛋白(图 1B)；进一步采用GST-pull down实验分析，结果显示GL23765和GL22084蛋白与PA互作(图 1C)。以上结果与质谱鉴定结果一致。

灵芝三萜的合成从乙酰辅酶A形成甲羟戊酸开始，经过甲羟戊酸途径中的酶催化反应，甲羟戊酸被催化合成羊角甾醇(合成途径明确)，羊角甾醇进一步反应形成三萜的催化过程还不清楚，但很可能包括细胞色素P450超家族的一系列氧化、还原和酰化反应等；灵芝中有78个细胞色素P450基因与羊角甾醇合成酶基因共表达，其中16个最有可能直接参与灵芝三萜合成[23]。最近的研究发现，cyp5150l8、cyp512a2、cyp512v2和cyp512a13与灵芝三萜单体合成直接相关[12, 24]。本研究鉴定到一个PA互作的细胞色素P450蛋白(GL22084)，为后续深入解析PA直接调控三萜生物合成相关酶(CYP450) 的机制研究提供了借鉴。

MAPK磷酸化级联反应链是真核生物信号传递网络中的重要途径之一，调节着细胞的生长、分化、对环境的应激适应、炎症反应和基因表达等多种重要的细胞生理/病理过程[25]。在植物盐胁迫下，PLD产生的PA与植物MAP6结合，并促进其活性，调控细胞骨架微管的聚合和成束，参与耐盐响应[26-27]。相一致的是，本研究在灵芝中也鉴定到一个PA互作的MAPK蛋白(GL22084)，但GL22084在灵芝中的具体功能，尤其是在三萜合成中的调控作用，还有待后续研究。

鉴于脂质信号分子的重要性，采用不同的方法鉴定脂质分子互作蛋白研究已有报道，主要利用磁珠富集或脂质体富集结合质谱鉴定的胞外鉴定方法。例如，Jungmichel等利用磁珠法开展了动物肌醇磷脂互作蛋白的鉴定[28]，并采用GST-pull down实验进行了验证，该研究方法与本研究方案一致。Kim等利用主要含有PA的脂质体开展了植物PA互作的转录因子蛋白鉴定，并进一步利用鉴定蛋白的特异性抗体进行免疫共沉淀，通过脂质提取和脂类分子质谱鉴定，证明了鉴定蛋白与PA在胞内互作[22]。然而，胞内鉴定脂质分子互作蛋白依赖特异性蛋白抗体等因素，实验成功率较低，实验难度大，相关报道相对较少。此外，最近的研究还开发了基于荧光信号进行活细胞观测PA分子和监测PLD酶活的方法，为活细胞研究PLD介导的PA信号分子的生理功能奠定了基础[29-30]。