家蚕Smox基因的克隆及在TGF |
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转化生长因子-β(Transforming growth factor-β; TGF-β)是一类多功能的细胞因子，对细胞的增殖、分化、胞外基质的形成、胚胎发育、骨的形成和重建具有重要的作用。由于TGF-β作用的多功能性和广泛性，从1981年Robert发现TGF-β以来，对它的研究就沿着不同的方向展开，但对其信号传导的通路一直不清楚。直到近年来发现了细胞内信号转导蛋白Smad家族，才开始深入地研究TGF-β信号从膜到核转运的分子机理。
为了研究家蚕生理功能与TGF-β-Smads信号转导通路的关系，本论文对家蚕TGF-β-Smads信号转导通路中一些重要功能基因进行了解析。BmSmox基因是家蚕TGF-β-Smads信号转导通路中的一个关键功能基因，相当于哺乳动物Smad2/3的直系同源物。利用EST分析、PCR技术等从家蚕组织中克隆了BmSmox基因。为了分析BmSmox基因在家蚕TGF-β-Smads信号转导通路中的相关功能，采用与TGF-β-Smads信号转导通路中Smad2/3结合并负责运输的动力蛋白轻链Rob1基因作为TGF-β-Smads信号转导通路的调节器，利用Rob1基因的表达变化而改变BmSmox运输到细胞核内的状况，分析BmSmox基因的表达影响调控靶基因表达的变化规律。利用融合PCR技术构建pBac[A3-GFP-Rob1]表达载体，通过脂质体转染法将表达载体导入家蚕BmN细胞。用Real-time PCR技术，检测在过表达Rob1蛋白的条件下，家蚕BmN细胞中TGF-β-Smads信号通路中Smox基因和下游靶基因p21的表达化。
本研究得到的实验结果如下:
1.BmSmox基因克隆及生物信息学分析。通过检索相关数据库、电子克隆与实验克隆相结合，在家蚕中克隆到一个Smad直系同源基因，该基因位于2号染色体上，命名为BmSmox基因。BmSmox基因ORF框由1335bp碱基组成，编码444个氨基酸，克隆得到片段基本包含了整个功能域区域。利用生物信息学方法解析该基因氨基酸序列的结构和功能域信息:该序列编码的蛋白的等电点为7.9，分子量为49642.7058。其中第25到135位氨基酸序列为MH1区功能域，该区域可以直接与DNA结合;第249位到355位氨基酸序列为MH2区功能域，是特异的受体磷酸化位点。用克隆到的该序列与哺乳动物同源的Smad蛋白对比分析显示:由于羧基端MH2区有一段特异序列，即丝氨酸片段-SSxS基序，推测该基因与哺乳动物R-Smad家族类相近。同源性分析表明:家蚕BmSmox基因与其他生物的Smox蛋白序列同源性都达到75％以上，说明该蛋白在生物进化过程中十分保守，研究家蚕中的BmSmox基因功能对其他生物也具有重要参考的价值。
2.利用融合PCR获取GFP-Rob1融合蛋白序列。融合蛋白序列由A3-GFP和Rob1基因连接而成，两序列长度分别是1405bp和235bp，融合序列长度为1681bp(加酶切位点、His标签、保护碱基等)，在A3-GFP-Rob1融合片段两端加入SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点。酶切鉴定与测序分析表明扩增产物为目标融合蛋白A3-GFP-Rob1序列，获得的融合蛋白序列克隆进T载体。
3.pBac[A3-GFP-Rob1]表达载体构建。对上述构建的T载体重组质粒A3-GFP-Rob1用SnaBⅠ和NotⅠ进行双酶切，产物经胶回收纯化，将得到的融合片段连接到同样双酶切处理过的PiggyA3GFP表达载体中，构建表达载体pBac[A3-GFP-Rob1]。挑选pBac[A3-GFP-Rob1]阳性克隆PCR鉴定，测序验证表明载体构建成功。
4.表达质粒转染家蚕BmN细胞。实验结果表明:pBac[A3-GFP-Rob1]和pBac[A3-GFP-Rob1]+helper质粒中融合蛋白GFP+Rob1表达量较高，荧光强度较强，说明Rob1基因在BmN细胞中过表达。在相同的时间内，添加helper质粒的实验组较未添加组荧光更强。可能说明了在helper的帮助下，融合蛋白被随机插入的细胞基因组中，能随着细胞的分裂而复制到不同的细胞中，因此细胞同时分裂时，携带绿色荧光蛋白的细胞比例更高，所以荧光更强。
5.Real-time PCR技术检测BmSmox基因和下游靶基因P21的表达。研究结果表明:与未转入Rob1基因的对照组相比，过表达Rob1基因，BmSmox基因表达量降低，说明Rob1基因对BmSmox基因可能具有负调控作用。P21表达量微弱降低，说明了虽然BmSmox基因表达抑制，但是其抑制下游靶基因的作用不明显，该结果与预期存在一定差异，可能与未在Rob1基因表达最高时收集细胞有关。而添加helper质粒的实验组，过表达Rob1基因，BmSmox基因表达量降低，下游靶基因p21表达量也下降，说明了其抑制下游靶基因p21的作用表现出来。 TGF-β-Smads信号通路;家蚕;生理功能;分子机理 浙江大学 硕士 特种经济动物饲养 徐豫松 2012 中文 S881.2 68 2013-10-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间） |
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