(western blot)

一般是你先实验进行了一个电泳，然后把电泳后的产物（如DNA、蛋白质）通过印迹技术转移到一个膜上，然后使用特异性的能识别此产物的探针或者抗体来识别，从而检测产物。广泛应用于DNA、RNA、蛋白和抗原等。

今天记录一下western blot的实验操作步骤及注意事项。

将待检测蛋白质（或酶）经SDS-PAGE电泳后，转移到固相载体上，再用“抗体-抗原”免疫反应 或 “DNA-蛋白质”结合反应，鉴别膜上的蛋白质。用于蛋白质定性定量与相互作用研究，分析基因的表达程度。

检测方法：①放射自显影 ②偶联反应+显色（光化学）反应

SDS-PAGE——转膜——封闭——检测。

1、来到Lab，首先把实验用跑胶玻璃板洗干净烘干。

2、配电泳液，一般向内槽中加入250ml即可。 缓冲液250ml：225ml ddH2O + 25ml 10xTris甘氨酸电泳液 将胶板固定好。

3、配胶 一块1.0厚玻板，一般需要分离胶5ml，浓缩胶2ml。

分离胶：选择合适浓度，按照比例加入各组分。 1ml=1000μl

ddH2O 30%丙烯酰胺（30%Acr/Bis制胶液） 1.5M Tris-HCl（pH8.8） 10%SDS 10%APS TEMED（即PAGE胶促凝剂） 最后加入

防止向玻板间加胶时胶已凝固，所以配的分离胶要不断轻轻摇晃，并在1-2min内把胶加好

向玻板间加入分离胶5ml，加时尽量避免气泡。再向分离胶间加入1-2ml ddH2O，将分离胶压平稳。加水时注意轻轻缓慢加入。分离胶干后，倒出ddH2O，用吸水纸将残留的水吸干净。下一步加浓缩胶。

浓缩胶：按比例加入各组分 ddH2O 30%丙烯酰胺（30%Acr/Bis制胶液） 1.0M Tris-HCl（pH6.8） 10%SDS 10%APS TEMED（即PAGE胶促凝剂） 最后加入 配好浓缩胶后轻混匀，即刻加入到胶板的分离胶上面，加入2ml，插入梳子，等待其凝固。

浓缩胶凝固后，清洗干净玻板表面，竖直拔下梳子。

短玻板向内侧，推严实夹紧玻璃板，固定好胶架，正极对正极，负极对负极，放入电泳槽内。

向电泳槽内加入电泳液，加入量要溢出加满，上面尽量无气泡。

一般加Marker 10μl，加样品 20μl。 盖上电极盖子。起始设置电压80v，待样品跑完浓缩胶，进入分离胶后，电压调整为120v。（140v、160v可根据试验需求，适当调整）

待样品跑完整块凝胶后，停止电泳，将内槽液体丢弃（防止蛋白有溢出，再次用可能会交叉污染）。

将凝胶取下，切去浓缩胶，剩余分离胶部分，泡入转膜工作液中， 滤纸—泡入转膜工作液，PVDF膜，先用甲醇（乙醇）活化30s，再放入转膜工作液中。

放置顺序 负极 ———— 滤纸 ———— 凝胶 ———— PVDF膜 ———— 滤纸 正极

凝胶上的蛋白带负电，向正极方向转移，从而转移到PVDF膜上

转膜缓冲液（10x）1L ： Tris 30.3g + 甘氨酸144g + 不调pH值 转膜工作液（1x） 1L ：10x转膜缓冲液100ml + 甲醇（无水乙醇）200ml + ddH2O 补齐到1L。

向槽内加入转膜工作液。将印迹槽放入到泡沫箱中，盖上电极盖子。周围加冰水混合物覆盖降温，防止产热过多。

转膜恒流。可设置300mA，60min，转膜电流与时间的设置可调整。转膜开始。

从封闭起的所有步骤，PVDF膜一定要保湿，不要使其离开液体环境太久，否则极易产生很高的背景，加液换液要迅速

取出转膜完成的PVDF膜，用5%脱脂奶粉封闭15-30min。

倒掉脱脂奶粉，加入一抗，振摇1h，吸出一抗。

PBST振摇漂洗3次，每次10min，吸出漂洗液。

加入二抗，振摇速度以液面轻晃为宜，孵育50-60min，吸出二抗。

PBST振摇漂洗3次，每次10min，吸出漂洗液。

PBST：PBS + 吐温20，吐温20的终浓度为0.05%（体积比）。即2L PBST配制：需要 2000ml X 0.05% = 1ml 吐温20。

将PVDF膜取出，竖直用吸水纸吸吸水分，放置在成像板上，滴加ECL化学发光剂于膜上（全覆盖均匀）。选择程序20帧30s，化学发光，曝光，成像，读取结果。

5%脱脂奶粉：2.5g脱脂奶粉→50ml PBST中

一抗：按说明书稀释，一般一抗稀释1000倍，用PBS稀释（可反复使用多次），或用脱脂奶粉稀释（反复用不久）。

二抗：按说明书稀释，一般稀释4000-5000倍，用PBST稀释。

ECL化学发光试剂：白瓶+黑瓶，现用现配，1:1比例配用。 一般一张膜 250μl 即够用。 配制方法：白瓶 250μl + 黑瓶 250μl，混匀，直接取 250μl 滴加到成像板上的PVDF膜上。

附上分离胶/浓缩胶常用配制浓度及体积