在上部分内容中介绍了Western blot 的详细步骤，这一部分就结合个人经验，对操作过程中的的注意事项，易出现的问题及易犯的错误进行复盘，从细节拿捏，就按照上部分内容的操作流程顺序挨个来了哦o(*^＠^*)o

1 总蛋白提取

总蛋白提取是 Western blot 的第一步，也是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题：

整个过程应在低温下进行（我都是在冰上操作的），以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰。

在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。蛋白裂解液一定要加蛋白酶抑制剂（PI）和磷酸酶抑制剂（PPI），保证蛋白质的完整性。

样品建议分装成合适的量（比如分装出 20μL用于蛋白质定量），然后于 -20℃ 或 -80℃ 中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。

2 蛋白定量

有条件一定要测定蛋白浓度，之前也有看到基于细胞计数+调内参的Western，我也尝试了，事实是我们不能保证每次处理条件绝对一样，在特定处理下，内参的表达也会发生改变。如果第一次内参不齐，下次调整上样，到底调整多少，也很难估量，做一次western大概需要一天多，第二次内参也没调齐的话就浪费了很多很多时间，远不如在开始时就用蛋白浓度计算得到上样量，这样的上样准确且方便。

3 免疫印迹

清洗玻璃板：玻璃板用洗洁精轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干（或在烘箱烘干或用吹风机吹干）。玻璃板一定要洗干净，不然到时候胶不匀就可能跑出来波浪形的条带。

玻璃板固定时，需对齐放入夹中卡紧，灌胶前可先往玻璃板间灌水进行检漏。

配胶：配制分离胶应选择合适的浓度，分子量越大，则胶浓度越小。配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜，特别是过硫酸铵。因为 TEMED 催化过硫酸铵释放相关化学基团，再由过硫酸铵释放的基团催化 Acr/Bis 聚合，所以如果过硫酸铵不新鲜的话加再多的 TEMED 效果也不佳。加入 TEMED需快速摇匀。

灌胶：灌胶时掌握好速度，开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。然后加入无水乙醇（或者ddH2O），液封后的胶凝的更快。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形。

上样：加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品。根据蛋白浓度，计算含 50～100 μg 蛋白的溶液体积即为上样量。当计算得到相同上样质量所需体积后，会发现上样体积是不一样的，保证最后的上样体积和样品中的离子浓度一样也是跑出相同宽度完美条带的必要条件。一般是在蛋白样品中+1×loading补齐至一样浓度，marker也会补相应的loading。上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。上样量一般10-15ul，最好不要超过20μL.

电泳：每个实验室电泳时间和电压都有差异。按照各实验室的惯例或者电泳槽的使用说明来操作即可。

转膜：转膜这一步真的是很重要了，有好几次我都败给了转膜，以下几点一定要注意：（1）PVDF膜一定要浸泡在甲醇中活化，不活化转不过来；（2）制作转膜三明治一定要按照黑面-海绵-滤纸-电泳胶-PVDF膜-滤纸-海绵-白面的顺序依次放置，放错转不过来；一定要注意赶尽气泡，不然转膜之后有气泡的的地方没转过来，然后影响整个转膜结果。另外，一层一层放置膜和滤纸时，要先把滤纸或者膜的一边放到胶上，然后缓缓把剩下的滤纸覆盖到胶上，可以避免有气泡。

孵育抗体：

一抗很贵，所以尽量回收。可以用含叠氮钠（起到一定的抑菌作用）的5%BSA进行抗体稀释，4℃放置。一次可以配4-5ml，可以用2-3个月。一抗的最佳工作浓度要自己慢慢摸索，设几个浓度梯度1：500，1：1000，1：2000，慢慢来吧ε=(´ο｀*)))

注意上述事项基本上就可以跑出漂亮的条带了。

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