01

试验部分

取样品于聚丙烯离心管中，加入乙腈溶液，涡旋提取，加入QuEChERS盐包，立即涡旋后离心。分取上清液，加入甲醇溶液，涡旋混匀后按照仪器工作条件分析。

02

结果与讨论

2.1 提取溶剂的选择

乙腈和甲醇是提取真菌毒素最常见的溶剂，在上述提取溶剂中加水，有利于基质的分散和提取溶剂的渗透，从而提高真菌毒素的提取率。试验考察了6种提取溶剂 (乙腈，体积分数分别为10%，20%，30%的乙腈溶液，含体积分数分别为1%，5%甲酸的10%乙腈溶液，分别记为 A，B，C，D，E，F)对加标样品(加标量为3倍测定下限)中5种真菌毒素回收率的影响，结果见图1。

由图1可知：对于果汁基质，6种提取溶剂所得5种真菌毒素的回收率均大于80.0%，其中乙腈溶液的提取效果略好于纯乙腈的；对于果酒基质，乙腈提取后5种真菌毒素的回收率不佳，加水后提取效果明显改善，当乙腈溶液体积分数为10%时，5种真菌毒素的回收率均大于80.0%，乙腈溶液体积分数继续增大或在 10%乙腈溶液中加入甲酸后，部分真菌毒素回收率减小。综合考虑，试验选择的提取溶剂为10%乙腈溶液。

2.2 净化方法的选择

果汁或果酒样品中含有色素等杂质，可能影响5种真菌毒素的测定，需要先净化再测定，试验分别采用QuEChERS盐包和固相萃取法净化提取液，固相萃取柱选择Waters Qa-sis PRIME HLB净化柱，分别记为净化方法1，2,，3，考察了3种方法对加标样品中5种真菌毒素回收率的影响，结果见图2。

由图2可知：净化方法1和净化方法3的净化效果相当，PSA对桔青霉素和霉酚酸有明显吸附，导致其回收率较低。考虑到净化方法3所用Wa-ters Qasis PRIME HLB净化柱价格较昂贵，QuEChERS盐包更经济实用，试验选择采用QuEChERS盐包净化提取液。

2.3 质谱条件的选择

将单标准储备溶液注入质谱仪，分别在ESI＋、负离子(ESI-)模式下进行一级质谱扫描，5种真菌毒素在ESI＋模式下响应较ESI-的高，因此试验选择在ESI＋模式下进行一级质谱扫描，并对母离子进行二级质谱扫描，选择响应较强的两个子离子作为定量、定性离子，在MRM模式下优化去簇电压和碰撞能量。优化后的质谱参数见表1。

2.4 色谱条件的选择

2.4.1 流动相

流动相不仅影响色谱峰峰形、分离度等参数，还影响目标物的质谱ESI源离子化效率，进而影响目标物测定。试验首先尝试采用甲醇-水体系和乙腈-水体系作流动相，5种真菌毒素的响应、峰形和分离度均较差；以甲醇-0.1%甲酸溶液体系和乙腈-0.1%甲酸溶液体系作流动相进行梯度洗脱时，5种真菌毒素的响应增强，分离效果变好，但是桔青霉素在用乙腈-0.1%甲酸溶液体系作流动相时的峰形存在拖尾现象。因此，试验选择的流动相为甲醇-0.1%甲酸溶液体系。

2.4.2 色谱柱

试验考察了分别以 Agilent ZORBAX Eclipse C18色谱 柱、Thermo Acclaim RSLC C18色 谱 柱 和 Waters BEH C18色谱柱等3种常见C18色谱柱作固定相时对5种真菌毒素分离效果的影响。结果显示，以3种色谱柱分离时,5种真菌毒素峰形和分离度均较好，说明这5种真菌毒素对C18色谱柱填充粒径的选择性不强。综合考虑，试验选择的固定相为Thermo Acclaim RSLC C18色谱柱。在优化的仪器工作条件下，5种真菌毒素的典型色谱图见图3。

2.5 基质效应

基质效应(ME)分为基质抑制效应和基质增强效应，是影响ESI源离子化效率的重要因素之一，试验参考文献以基质匹配单标准溶液系列(稀释剂为空白纯果汁样品溶液)、单标准溶液系列(稀释剂为乙腈)制作的标准曲线的斜率(k1，k2)计算ME值[100%×(k1/k2-1)]。根据试验结果可知，试验选择采用基质匹配法定量，以空白纯果汁样品溶液作代表性稀释剂配制基质匹配单标准溶液系列。

2.6 工作曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件测定基质匹配单标准溶液系列，以各真菌毒素的质量浓度为横坐标，其对应的峰面积为纵坐标绘制工作曲线，线性参数见表2。分别以3，10倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N)，结果见表2。

2.7 精密度、回收试验及样品分析

按照试验方法对市售常见两种阴性果汁(纯果汁、果汁饮料)和两种阴性果酒(发酵型果酒、配制型果酒)进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验，每个浓度水平平行测定6次，计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD)。根据试验结果，说明5种真菌毒素在果汁和果酒基质中都具有良好的准确度和精密度。按照 试验方法分析100批实际样品，根据试验结果，41批果汁中有两批检出了青霉酸，各1批检出了霉酚酸和黄绿青霉素，其余两种真菌毒素未检出；59批果酒中有1批检出了青霉酸，两批检出了霉酚酸，其余3种真菌毒素未检出，说明果汁和果酒中存在一定真菌毒素的污染。

3

论文总结

本工作以QuEChERS结合超高效液相色谱-串联质谱法测定果汁和果酒中5种真菌毒素的含量，该方法前处理简单、快速,方法灵敏度和准确度高，可为果汁和果酒中真菌毒素的检测以及相关国家标准的制修订提供技术参考。

作者：刘娜，辜慧，李旭，佘城，闵宇航，李澍才

单位：1.四川省食品检验研究院；

2.国家市场监管重点实验室(白酒监管技术)

来源：《理化检验-化学分册》2023年第8期返回搜狐，查看更多