烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 (NOX) 是在体内组织和器官中广泛分布的一种膜蛋白,因其能通过NADPH依赖的单电子还原将体内氧分子还原成超氧负离子,是体内活性氧簇 (reactive oxygen species,ROS) 的主要来源,也是体内唯一直接产生ROS的酶[1]。活性氧簇,如超氧化物、过氧化氢和羟基自由基等在体内具有免疫防御作用,也可作为第二信使,参与细胞信号通路的调节,维持细胞内环境的稳定[2]。在人类细胞中,NOX家族蛋白含有7种 亚型,其中NOX1～5为6次跨膜蛋白,DUOX1与DUOX2为7次跨膜蛋白。此外,NOX的激活还需要其他的一些亚基和调控蛋白[3]。

研究表明,NADPH氧化酶催化产生的ROS在细胞内氧化应激反应中扮演着重要角色,并在加速纤维化[4]、炎症和肿瘤形成[5]等病理过程中起着重要作用。NOX依赖的ROS与诸如心血管疾病、神经退行性疾病、糖尿病及其并发症、癌症等多种疾病相关[6]。因此,NOX被认为是治疗这些病理紊乱与疾病的一个潜在的药物靶点。多种结构类型的NOX抑制剂也随之出现。本文将对NOX参与的病理过程及其抑制剂的研究进展作一综述。

NOX2 (通常也称作gp91phox) 是首个发现的NOX家族蛋白[7]。NOX2拥有6次跨膜的结构域,C-末端和N-末端都伸向细胞质中,C-末端含有高度保守的NADPH和FAD的结合区域,该区域对于将NADPH中的电子转移到氧分子形成超氧化物起着决定性作用。NOX1是第一个被发现的NOX2的同源蛋白,与NOX2有60% 的氨基酸序列保持一致,同样在C-末端拥有高度保守的NADPH和FAD的结合区域[8]。其他的NOX家族蛋白也都是基于NOX2的蛋白序 列而发现的NOX2的同源物,包括: NOX3～5以及DUOX1与DUOX2。不同的NOX蛋白亚型在结构特征、活化机制 (图 1) 以及体内分布 (表 1)[9, 10, 11] 都存在一定的差异。

NOX蛋白本身几乎没有催化活性,它们需要与多种调节亚基结合,形成稳定的复合物,才能发挥催化作用[12]。首先,NOX蛋白的稳定需要辅因子,第一个发现的辅因子是p22phox,p22phox是一个两次跨膜的蛋白,它与gp91phox结合形成一个在558 nm处有强吸收的复合物,故将此复合物称作cytb558。p22phox没有催化活性,但是对于NOX蛋白复合物的稳定起着重要作用。p22phox是NOX1～4必需的一个辅助因子。除了p22phox外,NOX1～3的激活还需要多个调节亚基。NOX2中,在未激活的情况下,3个多畴调节亚基

p40phox、p47phox和p67phox以一个复合物的形式存在于细胞质中[12]; 在受激活的情况下,p47phox磷酸化,整个复合物转移至细胞膜与膜上的cytb558结合,形成一个酶复合物。同样地,NOX1的激活需要NOXO1与NOXA1形成的复合物,NOXO1是p47phox的一个同源物,NOXA1是p67phox的同源物。此外,NOX1～3催化活性的发挥对诸如Rac1与Rac2等小分子GTP酶表现出不同程度的依赖性[13]。活化了的NOX通过黄素、血红素等辅基将电子从基质转移至氧分子,形成超氧化物。NOX4的活化不需要上述调节亚基,其活化机制尚不明确。但有研究表明,NOX4的活化需要聚合酶Poldip2[14]。

NOX5是结构最特异的一个亚型,尽管它与其他NOX家族蛋白一样,有一个6次跨膜的结构和高度保守的C-末端,但它的N-末端比其他NOX蛋白的大并拥有4个与Ca2+结合的EF-手结构域。EF-手结构是Kretsinger在用X射线晶体衍射分析Ca2+结合蛋白的三维结构时提出的蛋白结构模型[15],该结构域与细胞内Ca2+的结合对NOX5的活性调节起着决定性的作用。虽然NOX5可以与p22phox结合,但是它的活性不会因为p22phox的缺失而减弱[16],说明NOX5的活化不需要p22phox。

DUOX1与DUOX2在结构上有很大的独特之处。DUOXs与其他NOX蛋白相比,有一个额外的 跨膜区域,这使得它的C-末端与N-末端分处细胞膜内外两侧。此外,DUOXs拥有一个细胞外的N-末端的过氧化物酶样结构域。然而,人类DUOXs是否能够发挥过氧化物酶活性尚未被确定。与NOX5一样,DUOXs的N-末端也有与细胞内Ca2+结合的EF-手结构域,DUOXs有两个EF-手结构域,同样对其活性 的调节起着决定性作用[17]。与NOX1～4不一样的是,DUOXs不需要p22phox,但DUOX1与DUOX2的稳定及活化分别需要DUOXA1与DUOXA2[18]。

NOX几乎存在于所有的哺乳动物细胞中,其功能是催化氧分子的还原,形成超氧化物或过氧化物等活性氧簇。NOX催化产生的ROS在许多生理学 过程中都起着重要作用,最主要的是免疫防御作用。NOX催化产生的ROS在由病原微生物介导的呼吸爆发中扮演着关键角色。呼吸爆发是指再灌注组织重新获得氧供应的短时间内,激活的中性粒细胞耗氧量显著增加,产生大量氧自由基,又称为氧爆发,这是再灌注时自由基生成的重要途径之一[19]。该过程中,中性粒细胞与巨噬细胞产生大量ROS,杀伤吞噬进入细胞的病原体。NOX功能的缺失能导致中性粒细胞与巨噬细胞功能紊乱,引发慢性肉芽肿病 (CGD),CGD为一种免疫缺陷症,表现为无法根除细菌感染[20]。除了免疫作用外,NOX催化产生的ROS也参与到细胞增殖、凋亡、血管生成、内分泌和细胞外基质的氧化修饰以及信号通路的调节等生理过程[21, 22]。

氧化应激是指机体受有害刺激时ROS产生增多或清除减少,导致ROS在体内蓄积而引起分子、细胞和机体的损伤。正常生理条件下,机体的抗氧化系统和氧化能力之间保持着相对的动态平衡,机体产生的ROS能迅速地被体内抗氧化系统清除[23],但在某些病理情况如高血糖状态下,包括NADPH氧化酶、醛糖还原酶以及蛋白激酶C被激活,刺激体内的ROS过度产生,并导致机体抗氧化能力下降,当氧化能力大大超过抗氧化能力时引发氧化应激[24]。氧化应激参与了包括血管疾病、肾脏疾病、癌症与老化等多种疾病的病理过程[25]。

细胞内产生ROS的酶有多种,如黄嘌呤氧化酶、细胞色素P450、环加氧酶、脂氧合酶、一氧化氮合成酶和NADPH氧化酶等。其中,除了NADPH氧化酶将催化产生ROS作为唯一功能外,其他的酶产生的ROS都是作为催化过程中的副产物出现的。NADPH氧化酶催化产生的ROS是吞噬细胞呼吸爆发以及非吞噬细胞氧化应激过程中ROS的主要来源[1]。

炎症是机体针对外源病原体或异物的免疫防御性反应。在外源病原体或异物入侵的先天性免疫反应中,机体会发生急性炎症反应,伴随着血管舒张、血管渗透性增加和白细胞迁移。这个过程虽然有利于病原体或异物的清除,但是如果不加以控制,可以导致机体的损伤和疾病的发生[26]。

NOX催化产生ROS在炎症过程中起到重要作用。在炎症部位,中性粒细胞中的ROS产生增多,引起血管内皮功能障碍和组织损伤。血管内皮是大分子和炎性细胞从血液转移至组织的通道。在炎症条件下,中性粒细胞产生的ROS导致血管内皮间隙开放,促进炎症细胞穿越内皮间隙转移至组织。转移的炎症细胞在清除病原体或异物的同时,也对组织产生损伤[27]。

纤维化是许多慢性炎症性疾病共同的、最终的病理特征,主要由大量的细胞外基质在炎症组织和受损组织周围沉积而引起[28]。细胞外基质由纤维组织母细胞和肌纤维母细胞合成,这两种细胞主要由生长转化因子 (TGF-β) 进行调控,TGF-β是纤维化发生过程中起主要调节作用的一类细胞因子。

近年来,大量的研究表明,NOX依赖的氧化还原信号在TGF-β调节的纤维化过程有着重要影响,尤其是NOX4在这个过程中扮演着关键的角色[29, 30, 31]。一方面,NOX4可以作为TGF-β调节纤维化过程的下游信号直接影响纤维化过程,主要表现在TGF-β可以增加纤维化组织中NOX4基因的表达,而NOX4催化产生的ROS则可以促进纤维化反应[32]。另一方面,NOX依赖的氧化还原信号也能够以一种反馈的形式调节TGF-β/Smad信号通路,从而间接促进纤维化过程[4]。

肿瘤由基因突变引起,并在特殊的环境中生长发展。NOX催化产生的ROS对肿瘤形成和肿瘤微环境中信号的传导起着重要作用[33]。一方面,NOX催化产生的ROS可以导致DNA损伤和基因组的不稳定,引起肿瘤的发生。另一方面,肿瘤细胞中NOX被过度激活,肿瘤细胞产生大量的ROS,调节肿瘤环境中的信号转导,有利于肿瘤的生长发展[34]。研究表明,用NOX抑制剂抑制NADPH氧化酶的活性,可以抑制体内肿瘤的生长,因此,NOX可能成为未来肿瘤防治的一个新靶点[35]。

早期发现的NOX抑制剂 (图 2) 大部分都是非特异性、非选择性的NOX抑制剂[36]。这些抑制剂能够产生脱靶效应,在作用于NOX的同时,也能作用于其他的一些酶。其中二亚苯基碘 (DPI,1) 与荚竹兰乙酮 (2) 在实验中一直沿用至今。DPI是一个广泛的黄素蛋白抑制剂,能够抑制一氧化氮合酶、黄嘌呤氧化酶以及线粒体电子传递链上的其他蛋白[37]。荚竹兰乙酮已被证明是一个ROS清除剂,而并非直接作用于NOX[38],此外它还能作用于Rho激酶[39]。用这些抑制剂对NOX研究所得出的结论是不可靠的,因此,NOX的研究需要新型的具有特异性和选择性的抑制剂。

随着NOX在氧化应激、炎症、纤维化与肿瘤形成等病理过程中作用研究的深入,NOX已经成为治疗糖尿病肾病、特发性肺纤维化、癌症等相关疾病的热门靶点。多种新的结构类型的NOX抑制剂随之出现,但是由于研究时间尚短,除了GKT137831已经完成了以糖尿病肾病为适应证的Ⅱ期临床试验外,其他的一些NOX抑制剂都停留在初步研究阶段。

GenKyoTex公司通过对136 000个化合物的高通量筛选发现了吡唑并吡啶二酮类化合物(图 3) 具有选择性的NOX抑制活性[40]。其中化合物3在体外的无细胞系统中对NOX4抑制 的Ki值为373 nmol·L-1,是对NOX2抑制活性 (Ki = 4 720 nmol·L-1) 的12倍。但是,在体内药代动力学研究中发现化合物3有严重的首关效应,口服生物利用度低[41]。

通过对化合物3的改造,发现了GKT16901 (4) 与GKT137831 (5)。其中,GKT137831对NOX1与NOX4抑制的Ki值分别为110与140 nmol·L-1 [42]。该化合物具有良好的药代动力学性质与安全性,已于2015年5月完成了以糖尿病肾病为适应证的Ⅱ期临床试验,目前结果尚未公布。吡唑并吡啶二酮类化合物作为一类选择性的NOX1与NOX4抑制剂,有望开发成一类新型的糖尿病肾病与特发性纤维化的治疗药物。

三唑并嘧啶衍生物 (图 4) 是Vasopharm公司发现的一类NOX抑制剂。在他们报道的11个化合物中,VAS2870 (6) 和VAS3947 (7) 最有前景,对NOX2高表达的人早幼粒白血病细胞株 (HL-60细胞) 抑制活性IC50值小于2 µmol·L-1 [43, 44]。但是,并没有关于VAS2870与VAS3947对其他NOX家族蛋白作用的详细报道。

由于VAS2870与VAS3947溶解性与药代动力学性质较差,使得其在体内实验中的研究受到了限制。另外,Sun等[45]发现VAS2870能够通过亲核反应使得半胱氨酸上的硫醇烷基化,在体外对兰尼碱受体钙通道 (RYR1) 和谷胱甘肽 (GSH) 产生影响。此类NOX抑制剂的研究需改善其成药性,还需对S原子进行改造以减少脱靶效应,另外,其选择性还需更多的实验与数据支撑。

Shionogi公司报道了一类以吡唑并嘧啶为母核的化合物可作为NOX抑制剂。大部分化合物都是在R1和R5进行取代基的变动,这些化合物对牛主动脉瓣膜上NADPH氧化酶的抑制活性的IC50值小于1 µmol·L-1,Shionogi公司称这类化合物可以抑制中性粒细胞以及血管组织中的NOX2[46]。

然而,Gatto等[47]在对此类化合物的作用机制的研究中发现,此类化合物在无细胞系统中对半重组NOX2并无任何抑制作用,对βⅡ型蛋白激酶C (PKCβⅡ) 有较强活性,其中化合物8与化合物9 (图 5) 的IC50值分别为4.6与9.4 nmol·L-1。考虑到PKCβⅡ在中性粒细胞中对于NOX2的激活极为重要,故推测这类化合物可能是通过抑制PKCβⅡ的活性而间接抑制NOX2的激活。

吩噻嗪类化合物 (图 6) 是通过以人结肠癌细胞系HT29细胞为基础的高通量筛选发现的一类NOX抑制剂。Gianni等[48]通过实验证明,这类化合物的代表ML171 (10) 对NOX1的抑制活性IC50值为130～250 nmol·L-1,比对NOX2、3、4以及黄嘌呤氧化酶的抑制能力要高出20倍。此外,ML171对线粒体ROS的形成并没有抑制作用,它能够通过减少ROS依赖的ECM的降解,从而特异性的阻断结肠癌细胞侵袭伪足功能的形成,妨碍结肠癌细胞的转移。

Seredenina等[49]发现,在吩噻嗪母核的N原子上用脂肪胺链取代时 (如化合物11),该类化合物则对NOX2、4、5抑制活性增强,对NOX1和NOX3抑制活性减弱; 当C环的2位用甲硫基取代时 (如化合物12),则对NOX1与NOX3抑制活性较强。另外,他们还发现化合物12能够减少人成纤维细胞分化成肌纤维母细胞。吩噻嗪类化合物已作为抗精神病药物使用,说明这类化合物有较好的成药性,但是因其能作用于多巴胺和5-羟色胺等信号分子,脱靶效应的产生将会是这类化合物的主要问题。

雷公藤红素 (13) 是从卫矛科植物雷公藤中分离得到的一个活性天然结构 (图 7)。在细胞实验中,它对NOX1 (IC50 0.41 µmol·L-1) 和NOX2 (IC50 0.59 µmol·L-1) 抑制活性比NOX4 (IC50 2.97 µmol·L-1) 和NOX5 (IC50 3.13 µmol·L-1) 高。在无细胞系统中,它对NOX2 (IC50 1.24 µmol·L-1) 和NOX5 (IC50 8.4 µmol·L-1) 也表现出一定选择性。机制研究表明,雷公藤红素可以结合到p47phox上,从而干扰p47phox与p22phox的结合。然而,NOX4与NOX5的激活并不依赖p47phox,所以雷公藤红素对NOX家族蛋白的抑制可能还有其他更复杂的机制[50]。

红杉醇 (14) 是从红豆杉等植物中提取的一种天然产物,对糖尿病的治疗有一定的效果[51]。Chen等[52]在研究红杉醇治疗糖尿病的机制时发现红杉醇能够下调2型糖尿病大鼠肝脏中p22phox和p47phox的表达。Li等[53]通过进一步的研究发现红杉醇能够抑制2型糖尿病大鼠主动脉NOX4的表达。因其能影响NOX1～4所必需的稳定亚基p22phox的表达,故红杉醇有可能成为NOX1～4抑制剂。

中药历史悠久,很多中草药能够干扰体内的氧化还原平衡,对抗氧化应激[54]。其中有些中草药可能是作为ROS清除剂起作用的,其他的可能是通过干扰诸如NADPH氧化酶等产生ROS的酶而起作用的,因此,从这些中草药分离得到天然结构化合物是发现新型NOX抑制剂比较有希望的一个途径。

NOX2ds-tat最初称作gp91ds-tat,是含有18个氨基酸的多肽,其中9个氨基酸的序列模拟了NOX2上一个B-loop区域的氨基酸序列。可以特异性的妨碍B-loop区域与p47phox结合,选择性的影响NOX2的激活[55]。NOX2ds-tat的另外9个氨基酸序列与HIV-tat运输区域的氨基酸序列一致,该序列可以促进NOX2ds-tat内化进入细胞内。NOX2ds-tat在浓度为100 µmol·L-1时对无细胞系统中超氧化物生成的抑制率为80%,然而对完整的嗜中性粒细胞中超氧化物的抑制率却只有35%[56]。

NOXA1ds是以与NOX2ds-tat同样的药物设计 思路设计的NOX1抑制剂。它的11个氨基酸序列与NOXA1上和NOX1结合区域的氨基酸序列相同,可以特异性地结合到NOX1上,抑制NOX1的激活。生物学研究发现NOXA1ds能够选择性的抑制NOX1,而对NOX2、NOX4和NOX5没有作用[57]。多肽类抑制剂可以特异性的针对某一类NOX蛋白设计,具有较好的选择性,但是由于其低效和不能口服给药等特点,目前多肽类抑制剂仅用于实验中对NADPH氧化酶的研究。

以上几类具有代表性的NOX抑制剂的特点总结见表 2。

NOX在加速氧化应激、炎症、纤维化以及肿瘤等病理过程中的作用已经逐步明确,NOX抑制剂成为了治疗与之相关的疾病的一种新的策略。目前,GKT137831已经完成了以糖尿病肾病为适应证的Ⅱ期临床试验。然而其他的一些NOX抑制剂都停留在初步研究阶段,尚缺乏能特异性作用于NOX蛋白、选择性作用于不同NOX亚型、且具有良好成药性的NOX抑制剂。

现有的NOX抑制剂主要以高通量筛选获得,然而高通量筛选虽然可以快速地筛选数以千计的化合物,提供一些潜在的NOX抑制剂,但是却无法保证所筛选的化合物对NOX蛋白的特异性以及对不同NOX亚型的选择性。参考多肽类NOX抑制剂的设计思路,设计能够靶向干扰NOX蛋白与其亚基或调控蛋白相互作用的抑制剂是特异性的、选择性的NOX抑制剂发现的一种新思路。另外,目前NOX抑制剂的研究尚缺乏可靠筛选体系,建立一套完整的可靠的筛选体系对于选择性的NOX抑制剂的发现很有必要。