助力基础科研发高分：小鼠活体成像实验了解一下 |
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助力基础科研发高分：小鼠活体成像实验了解一下
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用微信扫码二维码 分享至好友和朋友圈 年中大促丨：400-080-3389；www.immocell.com 活体 成像 技术 jie du 一 小鼠活体成像技术简介 活体动物体内光学成像主要采用生物发光与荧光两种技术。生物发光是荧光素酶基因(Luciferase) 标记细胞或DNA，荧光技术则采用绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白等荧光报告基因和FITC、Cy5、 Cy7等荧光素及量子点(quantumdot, QD)进行标记。 一 技术简介 ——标记原理—— 哺乳动物生物发光，一般是将Firefly luciferase基因（由554个氨基酸构成，约50KD）即荧光素酶基因整合到预期观察的细胞染色体DNA上以表达荧光素酶，培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株，当细胞分裂、转移、分化时, 荧光素酶也会得到持续稳定的表达。基因、细胞和活体动物都可被荧光素酶基因标记。将标记好的细胞接种到实验动物体内后，当外源（腹腔或静脉注射）给予其底物荧光素(luciferin)，即可在几分钟内产生发光现象。这种酶在ATP，氧存在的条件下，催化荧光素的氧化反应才可以发光，因此只有在活细胞内才会产生发光现象，并且发光光强度与标记细胞的数目线性相关。 除Firefly Luciferase外，有时也会用到Renilla Luciferase。二者的底物不一样，前者的底物是荧光素（D-luciferin），后者的底物是coelentarizine。二者的发光波长不一样，前者所发的光波长在540~600nm，后者所发的光波长在460~540nm左右。前者所发的光更容易透过组织，后者在体内的代谢比前者快，而且特异性没有前者好，所以大部分活体实验使用Firefly Luciferase作为报告基因，如果需要双标记，也可采用后者作为备选方案。 荧光素酶的发光是生物发光，不需要激发光，但需要底物荧光素。荧光素在氧气、ATP存在的条件下和荧光素酶发生反应，生成氧化荧光素(oxyluciferin)，并产生发光现象。
——底物荧光素的特点—— 荧光素由于诸多优点得到广大科研人员的青睐，主要特点如下： 1.荧光素不会影响动物的正常生理功能。 2.荧光素是280道尔顿的小分子，水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透细胞膜和血脑屏障。 3.荧光素在体内扩散速度快，可通过腹腔注射或尾部静脉注射进入动物体内。腹腔注射扩散较慢，持续发光长。荧光素腹腔注射老鼠后约1min后表达荧光素酶的细胞开始发光，10min后强度达到稳定的最高点，在最高点持续约20~30 min后开始衰减，约3h后荧光素排除，发光全部消失，最佳检测时间是在注射后15~35min之间；若进行荧光素静脉注射，扩散快，但发光持续时间很短。科研人员根据大量的实验总结出荧光素的合适的用量是150mg/kg，即体重20克的小鼠需要3毫克的荧光素。 4.观察时间的间隔没有最短限制，只要观察的条件控制一致就可以。虽然底物在动物体内有一定的代谢过程，但是上一次底物的残留曲线可以知道，可以控制对下一次观察结果的影响。 ——光学原理—— 光在哺乳动物组织内传播时会被散射和吸收，光子遇到细胞膜和细胞质时会发生折射现象，而且不同类型的细胞和组织吸收光子的特性并不一样。血红蛋白（hemoglobin）是造成体内可见光被吸收的主要因素，其吸收可见光中蓝绿光波段的大部分。但是在可见光大于600纳米的红光波段，血红蛋白的吸收作用却很小。因此，在偏红光区域, 大量的光可以穿过组织和皮肤而被检测到。利用活体动物生物发光成像技术最少可以检测到皮下的几百个细胞。当然，由于发光源在老鼠体内深度的不同可看到的最少细胞数是不同的。一般认为，每一厘米深度，发光强度衰减10倍，血液丰富的组织或器官（比如心脏、肝脏、肺脏）衰减多，与骨骼相邻的组织或器官衰减少。在相同的深度情况下，检测到的发光强度和细胞的数量具有非常好的线性关系，可由仪器量化检测到的光强度，反映出细胞的数量。 二 技术特点 优点 缺点 生物发光 1.适用于小动物的研究，灵敏度高，操作简单，无放射性； 2.特异性强，无自发荧光； 3.高灵敏度，在体内可检测到几百个细胞； 4.检测的深度在3-4厘米，精确定量。 1.无法标记小分子药物，暂不适用于人类和临床(正在研究中)； 2.信号较弱，检测时间较长，需要灵敏的CCD镜头，仪器精密度要求高； 3.需要注入荧光素，实验成本高； 4.细胞或基因需要转基因标记； 5.有些物质不能用生物发光标记，如抗体、多肽等； 6.很难用于人体。 其他体内成像技术 1.分辨率高，不需标记； 2.适用于小分子药物标记。 1.特异性差，在肿瘤很小时无法区分肿瘤细胞和正常细胞，并且对于肿瘤细胞的活跃程度不敏感； 2.小动物CT需要对动物有较强的X-射线照射，容易引起突变，对动物的生理有一定影响。 荧光 1.荧光染料、蛋白标记能力强，多种蛋白及染料可用于多重标记； 2.信号强度大，成像速度快； 3.实验成本低； 4.活体动物、动物尸体、器官全部可以进行成像； 5.可衔接体内实验和体外实验，保持研究的连贯性； 未来可能用于人体。 1.非特异性荧光限制了灵敏度，体内检测最低约10^5细胞； 2.检测深度受限制； 3.较难精确体内定量。 三 应用领域 —— 01肿瘤学—— 活体生物发光成像技术能够让研究人员能够直接、快速的测量各种癌症模型中肿瘤的生长、转移以及对药物反应。 —— 02药物研究—— 在药物代谢方面，标记与药物代谢有关的基因，比如CYP3A4等，研究不同的药物对该基因表达的影响，从而可以间接知道相关药物在体内代谢的情况。在药剂学研究方面，可以通过把荧光素酶报告基因的质粒直接装载在药物载体中，观察药物载体的靶向脏器与体内分布规律。在药理学方面，通过转基因小鼠的应用，观察药物作用的通路，用荧光素酶基因标记某一个兴趣基因，观察药物作用的通路。 —— 03基因治疗—— 这种可视的方法直观地评价DNA的转染效率和表达效率，在基因治疗研究中具有重要的指导作用。 —— 04干细胞及免疫学—— 用荧光素酶标记的干细胞、免疫细胞组成性表达的基因，做成转基因动物，干细胞就被标记了，若干细胞移植到另外动物体内，用活体生物发光成像技术示踪干细胞在体内的增殖、分化及迁徙的过程。 —— 05基因表达模式—— 研究基因表达可以从影响基因表达的各个不同的层面进行相关的研究，如利用融合蛋白( p27-luc融合蛋白研究其在Cdk细胞分裂周期的表达)，兴趣基因启动子控制的荧光素酶( Catenin在肿瘤转移的信号传导机制)，siRNA方式和转基因动物等方法。 —— 06蛋白质相互作用—— 其原理是将分开时都不单独发光的荧光酶的C端和N端分别连接在两个不同的蛋白质上，若是这两个蛋白质之间有相互作用，荧光酶的C端和N端就会被连接到一-起，激活荧光素酶的转录表达，在有底物存在时出现生物发光。 —— 07细胞凋亡—— 具体原理是用分子生物学方法在荧光酶的两端连接上抑制其发光的蛋白(如雌激素)，但在其连接处加上caspase (细胞凋亡时特异表达的一种酶)的酶切点。细胞发生凋亡时，表达caspase，切开抑制荧光酶发光的蛋白，使荧光素酶开始发光。 —— 08疾病机理—— 可以标记与某种疾病密切相关的基因，做成转基因小鼠，通过特定的药物作用或其他条件下该基因表达的变化， 来推测该疾病的发病机理和药物对疾病治疗的效果等。 —— 09其他—— 在荧光素酶基因的一-端接要研究的蛋白质的基因，另一端接肯定在细胞核内表达的蛋 白的基因，当核外的蛋白运输到核内时，就会导致荧光素酶N端、C端靠近，恢复发光。 四 实验操作流程 —— 01肿瘤细胞标记—— 首先用荧光素酶标记所要研究的肿瘤细胞，我们利用带luciferase基因，puromycin或blasticidin抗性的慢病毒载体，先包装成慢病毒，然后感染肿瘤细胞，最后抗性筛选出稳转luciferase的肿瘤细胞。接下来可以继续按照客户需求对该稳转细胞株进行其它基因改造操作。 —— 02体外预实验检测—— 需要检测的肿瘤细胞标记后，在活体成像前，可以通过检测荧光素酶的表达强度，绘制标记细胞的发光梯度曲线等。体外预实验是作为小动物活体成像解决方案中不可缺少的一部分。比如，利用体外预实验初步检测转染荧光素酶的肿瘤细胞发光值。 —— 03接种荧光素酶标记的细胞—— 接种方式按照实验目的不同有几种，原位接种，皮下接种，腹腔接种以及静脉接种，可分别观察原位瘤，皮下瘤以及转移瘤等。如果是人源的肿瘤细胞，必须用裸鼠作为受体，如果是鼠源细胞系则无所谓，但是前提是所用细胞必须能成瘤。 —— 04活体成像—— 细胞接种一段时间后，可以进行活体成像检测。首先麻醉实验动物，可采用异氟烷（isoflurane）或克他命/甲苯噻嗪（ketamine/xylazine）混合液麻醉实验动物。 接着注射底物荧光素，最佳的检测时间是在注射后10到35分钟之间。但需要注意的是，对于不同的动物模型，发光动力学过程并不完全一致，最好先进行预实验确定何时发光信号最强。 五 结果展示 ——4T1-LUC细胞——
—— HeLa-LUC细胞 ——
——hepa1-6-LUC细胞 ——
逸漠现货LUC细胞株 细胞来源 逸漠细胞库 NO. 细胞名称 01 T24-LUC 02 L929-LUC 03 22RV1-LUC-PURO 04 22RV1-LUC-BSD 05 SN12-PM6-LUC 06 MFC-LUC 07 Nalm6-LUC 08 HL-60-LUC 09 RM-1-LUC 10 ID8-LUC 11 DU145-LUC-BSD 12 MCF-7-LUC 13 MDA-MB-231-LUC 14 4T1-LUC 15 A549-LUC 16 CT26-LUC 17 K7M2 WT -GFP 18 SK-OV-3-LUC 19 AGS-LUC 20 786-O-LUC 21 LLC-LUC 22 PANC-1-LUC 23 MB49-LUC 24 B16F10-LUC 25 LLC-GFP-puro 26 SW620-LUC 27 SW480-LUC 28 HCT8-LUC 29 HT29-LUC 30 pan02-Luc 31 293T-LUC 32 HOS-LUC 33 A375-LUC 34 U20S-LUC 35 HEK293-eGFP 36 HEK293-copGFP 37 HCT116-LUC 38 RKO-LUC 39 RAMOS-LUC 40 SIHA-LUC 41 A431-LUC 42 T47D-LUC 43 SK-BR-3-LUC 44 RD-LUC 45 T98G-LUC 46 HELA-LUC 47 HEPG2-LUC 48 U87-MG-LUC 49 THP-1-LUC 50 NCI-H226-LUC 51 RAW264.7-LUC 52 E0771-LUC 53 A498-LUC 54 SCC7-LUC 55 PC-3-LUC 56 Caco2-LUC 57 CNE2-LUC 58 DU145-LUC-PURO 59 HGC27-LUC 60 HO8910PM-LUC 61 MG63-LUC 62 MKN45-LUC 63 hepG2-coGFP 64 7721-coGFP 65 hepa1-6-LUC 66 GL-261-LUC 67 H22-LUC-PURO 68 BXPC-3-LUC 69 143B-LUC 年中大促丨 相关业务需求，可添加下方微信号咨询： END 逸漠生物 构建专业细胞资源平台 涵盖细胞系、原代细胞 标记细胞、耐药细胞 培养相关产品 400-080-3389 www.immocell.com 深耕细胞技术 共筑人类健康 immocell丨细胞资源平台 特别声明：以上内容(如有图片或视频亦包括在内)为自媒体平台“网易号”用户上传并发布，本平台仅提供信息存储服务。 Notice: The content above (including the pictures and videos if any) is uploaded and posted by a user of NetEase Hao, which is a social media platform and only provides information storage services. /阅读下一篇/ 返回网易首页 下载网易新闻客户端 |
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