01样品采用梯度洗脱的原因

01 样品极性范围较大，具有较宽的K值范围。超出了等度洗脱的优先目标范围（1≤k≤20），若采用等度洗脱可能会导致样品运行时间过长，分离度不够或目标化合物残留未洗脱下来等问题，若采用梯度洗脱，则可以大大缩短方法的运行时间，提高分离效果，避免残留问题的发生等。

02 大分子化合物，尤其是生物样本，如多肽和蛋白质，等度条件下分离结果一般比较差，此外，因为他们的保留行为对流动相组成（%B）的微小改变非常敏感。例如有的蛋白质在色谱柱上的保留因子可能会因为%B改变1%而增加或减少3倍，使得方法无法在不同实验室甚至是同一实验室中得以重现。而梯度洗脱能够改善大分子化合物方法的重现性，而且分离的过程也往往比较快，效率高而且简便。

03 样品中含有晚出峰的干扰物，会污染色谱柱或者是在后续运行中才洗脱出来；此外，样品中若含有极性大的化合物，在等度洗脱的时候也可能会干扰鱼样品中前端出峰的目标化合物的分离，采用梯度洗脱往往就能够得到更好的分离，而可以省去样品处理的过程。

04 设置一个通用的梯度洗脱的方法用于分析一系列的样品，对于每一个新的样品可以不用再进行进一步的方法建立，能够在最短的时间内以最低的成本进行处理。

05 在建立一个未知样品的HPLC方法时，通常是以一个或多个梯度实验开始的，单个梯度实验能够替代一些反复试错的等度实验。通过初始的梯度实验也可以告诉我们，对于该样品是应该使用等度还是梯度洗脱的方法，同时找出等度分离中最佳的溶剂强度%B。

06 在等度洗脱的时候后出的峰出现了峰形变宽和拖尾的现象的话，可以考虑采用梯度洗脱，增加后出峰的洗脱，能够减少谱带展宽，改善峰形。

02 梯度洗脱条件的设置

对于一个未知样品，通常反相色谱条件最初的流动相梯度会参照如下方法进行设置。

如果在上述条件下，30分钟之后还有化合物被洗脱下来，则需要考虑更换保留能力更弱的固定相，或更换洗脱能力更强的有机溶剂，重新进行实验。

若化合物均在30分钟之前被洗脱下来了，我们则可以根据出峰的情况进行下一步的判断。

影响梯度变化的几个参数，主要有下面几个：

%Binitial 初始流动相比例

∆%B/min 梯度变化速率

%Bfinal 结束流动相比例

ti 开始有组分洗脱下来的时间

tf 最后一个组分完全洗脱下来的时间

tG 梯度洗脱的时间

∆tG 有组分洗脱下来的梯度时间

一般来说，如果有组分洗脱的时间∆tG超过梯度时间的25%时，该方法不适合等度洗脱，更适合使用梯度洗脱的程序，如果∆tG小于梯度时间的25%时，则方法适合等度洗脱的程序。

即∆tG＞0.25tG 该方法更适合梯度洗脱

∆tG≤0.25tG 则该方法适合等度洗脱

如果适合等度洗脱，可以根据以下方法来进行设置：

样品平均保留时间tr(avg)=(ti+tf)/2

流动相变化速率∆%B/min=(%Bfinal-%Binitial)/tG

等度洗脱选择的流动相比例为∆%B/min*tr(avg)+%Binitial

然后再根据运行结果进行调整

如果方法适合梯度洗脱，则可以根据以下方法进行设置：

优化后初始流动相比例

Opti%Binitial=%Binitial+ti*∆%B/min-Vd/F*∆%B/min-10%B

优化后结束流动相比例

Opti%Bfinal=%Binitial+tf*∆%B/min-Vd/F*∆%B/min-10%B

其中F为流速

Vd为Dwell Volumn,滞留体积，指的是从流动相混合点开始，到色谱柱的柱头这中间所有的体积。

计算公式为 Vd=td*F tD=t0.5 -0.5tG

目前一般近年来新出的仪器Vd都小于1ml，一些老旧型号的仪器Vd则可能偏大，会有几毫升。

03实例分析

若上述方法需要采用等度条件来洗脱，我们通过上面的等度洗脱的公式计算得到如下结果：

样品平均保留时间tr(avg)=(ti+tf)/2=(14.9+28.2)/2=22.55min

流动相变化速率∆%B/min=(%Bfinal-%Binitial)/tG=(100-5)/30≈3.17%

等度洗脱选择的流动相比例∆%B/min*tr(avg)+%Binitial=3.17*22.55+5%≈77

即若上述谱图采用等度洗脱，则可以选择水相：有机溶剂23:77的流动相条件下运行22.5min，然后再根据得到的结果进行微调即可。

若上述方法需要采用梯度条件来洗脱，我们通过上面的梯度洗脱的公式计算得到如下结果：

优化后初始流动相比例

Opti%Binitial=%Binitial+ti*∆%B/min-Vd/F*∆%B/min-10%B=5%+14.9*3.17-1/1*3.17-10%≈39%

优化后结束流动相比例

Opti%Bfinal=%Binitial+tf*∆%B/min-Vd/F*∆%B/min-10%B=5+28.2*3.17-1/1*3.17-10%≈82%

即若上述谱图采用梯度洗脱，则初始流动相可以选择水相：有机溶剂61:39梯度运行30分钟至水相：有机相18:82即可，然后再根据得到的结果进行微调。