前言

如果您还没有建立 HPLC 方法，要进行稳定而重复的分析，就需要进行方法开发了。具备进行成功方法开发的技能，对解决将来可能遇到的复杂分析极有帮助。

优化反相色谱条件

在确定了色谱柱规格、合适的固定相柱填料、流动相溶剂和改性剂后，即可开始优化方法。方法的优化是根据最终目标决定的。如果要开发质量控制方法，您可能会需要像等度分离这种可变因素较少的方法。如果目标是得到最高分离度，节省分析时间并不是首要问题，可以选择长柱使所有组分都得到最大分离度。如果分离速度很重要，则应使用短柱和高流速。对于含许多保留不同的目标化合物的复杂样品，用等度分离可能不能解决问题，应开发并优化梯度方法。

我们按约定俗成将水相溶剂和反相色谱中较弱的溶剂称为流动相“A”，“B”溶剂是有相组成较高和较强的溶剂。在反相色谱模式中，当增加 B 的百分比时，通常保留将减少。请注意，在还没有开发出样品的实际分析方法前，大部分人开发 HPLC 方法都是采用“反复实验”的方法，即，尝试各种不同流动相条件，以找出最佳条件。

等度（流动相组成不变）

等度优化的一般方法是不断改变流动相强度（%B），直到获得适当的保留范围。这种方法有时也称为“溶剂筛查”。对于简单的分离，k 值应在 1 到 10 之间。如果 k 值太低（比如，< 1），早洗脱的色谱峰可能不发生保留峰或融入基质组分，因此对其进行定量将非常困难而且不可重复。另外，低 k 值峰受柱外效应影响很大，可能会使峰展宽。如果 k 值太大（比如，> 10），分析时间将变得过长，检测限会因峰展宽而提高。

对于反相色谱中的等度方法开发是从流动相有机改性剂最高比例开始，然后逐渐降低。在降低流动相强度之前，先要确定所有组分都已从柱中洗出。如果组分保留在色谱柱中，以后可能在 B 相比例较低的流动相中洗脱，成为无法解释的“鬼峰”。通常，流动相以 +/-10%（如，90% B、80% B、70% B 等）或 +/-20% 的幅度改变。利用一些现代软件（如，ChromSword 的 ChromSword，ACD 的 AutoChrom），显示保留变化曲线，系统进行自动调节，更快得到优化条件。当接近最佳等度条件时，进行手动调节，幅度应减为 5% 或 3%。

请注意，如果流动相“A”中含高浓度缓冲液（比如，大于 25 mM），则不能使用 100% 的 B，因为当两种溶剂系统开始混合，随着 B 相百分比的减少，可能发生沉淀。一旦建立优化条件，如果目标还没有得到完全分离，则需继续提高选择性 (α)。如需分离两个相邻的色谱峰会涉及到许多实验参数的调节。温度可以作为一个变量。大多数现代仪器都具有某种类型的柱温控制器，大部分反相柱可以承受高达 60 ℃ 的温度，有些甚至更高。一般来说，升高温度可以缩短所有峰的保留时间，但对有些峰的影响可能与对其它峰不同，从而导致选择性发生变化。

其它用于改变选择性的变量如下：

1. pH（对于可离子化的化合物）

2. 缓冲液（离子）强度

3. 缓冲液类型（比如，磷酸盐、醋酸盐或甲酸盐，取决于需要的 pH 范围）

4. 流动相有机改性剂（比如，从乙腈变为甲醇或两者的混合液；可使用三元和四元流动相混合溶剂）

5. 流速（一般而言，由于提高了柱效，较低的流速可能对分离略有改善，但也有例外——见下面的提示）

6. 离子对试剂浓度（如果使用离子对 RPC）

如果调节这些参数还不能改善分离，那么最好的解决办法就是改变色谱柱或固定相。更长的色谱柱具有更多塔板数，因此有助于分离，但切记，分离度只能增加长度的平方根。柱长加倍使分析时间和溶剂消耗加倍，而灵敏度降低，但只能使分离度提高约 40%。改用较小粒度色谱柱也能增加塔板数，但柱压上升 。使用新的固定相（如 C18 换成苯基柱）需要进行一套新的溶剂筛选实验，耗费更多时间，但可能得到最佳的分离结果。但需要额外购买具有不同固定相的反相柱。

梯度（流动相强度随时间变化）

对于含各种组分的样品混合物来说，选择单一流动相组分可能得不到满意的解决方案（比如，一般洗脱问题）。例如，某些样品组分，如强极性分析物，可能很快从反相柱上被洗脱下来，而疏水性组分可能在疏水性的 C8 或 C18 上吸附非常强，洗脱不下来。对这一问题的解决方案是随时间改变流动相组成（梯度洗脱）。在绝大多数例子中，初始流动相非常弱（比如，含水量高），随时间的推移，有机溶剂的百分比通常是以线性形式增加

两种情况下要使用梯度洗脱的方法开发过程。一种是用梯度预测反相分离的最佳起始等度条件。大多数方法开发软件（如，DryLab、ChromSword、AutoChrom）都具有这项功能，最少进行两次梯度分离，然后预测出最佳等度条件。接下来就可以用这些条件进一步进行等度分离优化了。

第二种情况是开发梯度方法，并使用了宽范围的快速梯度（比如，10 分钟内 B 由 5% 变到 95%），确定目标化合物的最佳梯度范围。实际上，某些软件系统可以通过色谱数据系统/控制器之间的相互作用来设置最佳梯度，对分离进行优化。但是，手动操作也可以完成同样的工作，找到目标峰洗脱的流动相比例，然后通过下一次梯度，调节 k*（梯度等于 k）范围，让梯度分离在合理的时间内完成。

然后，与等度优化一样，当分离时间合理后进行选择性的确定。

几种常规的梯度设置

HILIC色谱柱

亲水相互作用液相色谱 (HILIC) – 有时也被称为“水相正相”(ANP) – 是一项已发展了数十年的技术。由于这项技术能够对反相柱上不保留或保留较差的极性化合物进行分析，近年来又重新受到了重视。而且，这项技术很容易与 MS 和 MS-MS 检测技术兼容。当 HILIC 分离使用高有机相流动相时，与水相缓冲系统相比由于具有较低的离子抑制，从而提高了 MS 灵敏度。

HILIC 使用极性固定相，如硅胶、氨基、混合模式、两性离子等，以及水溶性的、非极性流动相，由少量水（至少 2.5% 体积比）和高比例有机相组成。

在 HILIC 方法中，亲水、极性和带电荷化合物比疏水、中性化合物更容易保留。与反相液相色谱完全相反。

在流动相中加水会降低保留。HILIC 与正相色谱相比，能得到强极性溶质的良好峰形。是反相色谱的补充方法，由于保留了亲水性化合物，因此常使洗脱顺序倒置。

正相色谱

正相或吸附色谱的出现早于反相色谱。“正”的叫法源自其原本概念，即，固定相为极性、流动相为非极性、极性化合物保留更强。

在正相色谱中，使用硅胶或另一种极性固定相，如短链氨基或二醇。流动相为非极性——通常为烃类、二氯甲烷、乙酸乙酯，或另一种水溶性的溶剂。在正相色谱中，极性组分保留更强。随流动相极性增大极性组分保留减弱。使用的流动相极性越强，分析物的洗脱越快。在硅胶柱上进行正相梯度分离时，可以从己烷等非极性溶剂开始，然后逐渐加入极性溶剂，如乙酸乙酯，比如，乙酸乙酯从 5% 到 95%。根据目标物的洗脱位置，可以调节梯度以改善所有组分的分离。有时加入一定量的水或少量异丙醇，可以调节硅胶填料的表面活性。键合相色谱柱可能不需要水的存在，并常使用醇类作为改性剂。

我们使用正相色谱的原因之一是使更多的极性化合物得到保留。也可以用这种模式洗脱在反相色谱中高度保留的疏水化合物。

正相色谱有许多用途。适合分离几何异构体和位置异构体。可得到比反相色谱更高的分辨率。当我们没有水溶性的溶剂时，可以使用正相色谱。也可以用于制备分离，流动相不含水，易于蒸发。

总结：正相

• 柱填料为极性：硅胶（最强）>氨基>二醇>氰基（最弱）

• 流动相为非极性：己烷、异辛烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等

• 极性化合物保留更强

• 随流动相极性增大保留减弱

选择正相的目的：

• 分离高度保留的疏水样品

• 分离异构体

• 样品进样溶剂为非极性和/或非水溶性的

• 使用非极性溶剂进行回收

离子交换色谱

离子交换色谱可以分离离子型化合物和可离子化的化合物。在这种模式中，我们使用带有离子型官能团的填料，其所带电荷与分析物相反。在强阳离子交换 (SCX) 色谱中，我们要分析带正电荷的分子或阳离子，因此使用的是阴离子型或带负电荷的固定相。如果我们要分析带负电荷的分子或阴离子，应使用阳离子型或带正电荷的固定相。

在离子交换色谱中，流动相通常含水量较高，并含有缓冲液或盐。通过连续或阶梯梯度增加离子强度（盐浓度）进行洗脱。常用于对生物大分子的分离，也用于小分子的分离，如氨基酸、无机阳离子和阴离子，以及氨类或羧酸等可离子化的化合物。

离子交换色谱小结：

• 柱填料含离子基团（如，磺酸盐、四烷基铵）

• 流动相为水相缓冲液（如，磷酸盐、甲酸盐、TRIS 等）

• 比反相色谱用得少

• 与离子对色谱相似（更多信息请参见词汇表）

凝胶渗透色谱/体积排阻色谱

在 GPC/SEC 中，样品分子与填料之间不存在相互作用，并通过扩散进入多孔聚合物基质或硅胶基质的孔隙中。根据分子的体积大小和相应填料孔隙大小进行分离。体积比填料孔隙大的分子不能扩散进入填料，而体积比填料孔隙小的分子则可以进入填料，因此样品得到分离。与反相色谱不同的是，大分子先洗脱出来，小分子后洗脱出来。

通常，较大分子被排阻在孔隙之外，从而快速从色谱柱中洗脱出来，为完全排阻体积。最小的分子可以渗透入色谱柱的所有孔隙，最后洗脱出来，为完全渗透体积。其它所有分子在这两者之间按分子大小洗脱出来。如果要测定单个组分的分子量 (MW) 或整体分布，需要先用已知分子量的标样以洗脱体积对 log MW 建立校正曲线。然后，在与标样相同的条件下分析聚合物样品，即可测定该聚合物的分子量和分子量分布。

主要选用流动相溶解分析物。

GPC/SEC 小结：

• 两种模式：非水相 GPC 和水相 SEC（也称凝胶过滤色谱，或 GFC）

• 在体积排阻色谱中，样品分子与填料之间无相互作用，并通过扩散进入多孔聚合物基质的孔隙中。根据分子的体积大小和相应填料孔隙大小进行分离。在不同溶剂或流动相中可能得到不同的流体动力学半径。

• 主要选用流动相溶解分析物

• 主要用于聚合物表征、聚合物分子量测定和蛋白质分离

————————————————END—————————————————

关注微信公众号号“质谱学堂”有趣的灵魂在等你

精彩内容持续更新中……………..……关注有福利噢！！！

往期回顾

生物样品的采集；采血常用抗凝剂

临床试验的0,Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ期究竟是研究什么？Ⅱa,Ⅱb期又是什么东东？

如何减少质谱分析中 II相代谢产物 源内裂解

欧洲生物分析论坛关于溶血/高脂基质效应的建议

色谱柱的基本概念