铁皮石斛是兰科植物Dendrobium officinale Kimura et Migo的新鲜或干燥茎, 在我国已经有两千多年的药用历史。药典记载, 铁皮石斛具有益胃生津、滋阴清热、抗疲劳、祛痰镇咳等功效。自1963年开始, 铁皮石斛一直作为药材“石斛”项中的1个品种收录在《中国药典》。由于铁皮石斛突出的药理功效, 2010年版《中国药典》将其作为“铁皮石斛”单独收载, 并与中药石斛区别开来[1]。

现代研究证明, 铁皮石斛的主要化学成分为多糖、菲类、联苄和黄酮等, 多糖是其主要活性成分, 具有治疗胃肠道炎症、降血糖、调节免疫、抗氧化和抗衰老等多种药理活性[2]。

近年来, 大量关于铁皮石斛多糖结构组成和药理活性的研究陆续发表, 对铁皮石斛多糖作用机制的综述也多有报道[2, 3], 多糖一般具有肠道吸收较差、口服生物利用率低和使用量较大的特点, 并难以用传统技术手段完全阐明其药理活性[4]。多糖是潜在的优良益生元, 可以促进有益肠道菌生长[5, 6]。大量研究证明, 肠道益生菌在调节糖脂代谢、抗炎和调节免疫等方面均具有明显药理功效[7]。已有研究发现, 铁皮石斛多糖很可能通过促进肠道益生菌的生长发挥其生物活性, 这可能是未来铁皮石斛多糖作用机制研究的一个重要方向[8-10]。

本文对近年来铁皮石斛多糖在国内外的最新研究进展进行综述, 对铁皮石斛作用机制研究方向提出新的思考(图 1)。

干燥铁皮石斛中性糖的含量高达58.3%, 产地、加工方式、生长年限及栽培方式的不同均会影响铁皮石斛中多糖的含量[11]。从铁皮石斛中获取多糖的方法主要是水提醇沉法, 粗提物脱蛋白处理后经离子交换柱和凝胶柱分离纯化, 可得到均一化多糖。采用傅立叶变换红外光谱、气体色谱-质谱和核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)光谱等技术表征多糖的化学特征, 全面分析单糖组成、纯度、相对分子质量、连接方式等化学特征后研究其药理活性[12]。

回顾文献发现[13-15], 具药理活性的铁皮石斛多糖大多为O-乙酰化葡甘露聚糖, 重复单元骨架通常具有(1→4)、(1→3)或(1→6)连接的糖基残基(图 2)。Hua等[13]证实可从干燥铁皮石斛中分离纯化得到1种均一2-O-乙酰化葡甘露聚糖, 分子质量为1.3×105 Da, 该均一多糖以(1→4)连接的β-D-吡喃甘露糖基残基和β-D-吡喃葡萄糖基残基为骨架, 药理研究证实该多糖具有改善小鼠溃烂性结肠炎和抑制结肠癌发生/发展的作用[14, 15]。另1种从铁皮石斛中获得的分子质量为3.12×105 Da的(1→4)连接的O-乙酰化葡甘露聚糖也可明显改善小鼠结肠病理症状[16], 并具有体内外免疫调节的活性[17-19]。铁皮石斛多糖的平均分子量大小与其药理活性无直接相关性[20, 21], 许多平均分子量较小的铁皮石斛多糖也具有显著的功效。例如从铁皮石斛中获得的1个低分子量O-乙酰化葡甘露聚糖, 平均分子质量为1.543×104 Da, 重复单元由β-(1→4)-D-吡喃甘露糖基残基、β-(1→4)-D-吡喃葡萄糖基残基和β-(1→3, 6)吡喃甘露糖基残基组成, 对机体细胞免疫和体液免疫系统均表现出调节活性[20]。Luo等[21]从铁皮石斛中提取并纯化得到的具有抗氧化活性的2-O-乙酰化葡甘露聚糖的平均分子质量为8 500 Da, 单糖成分分析表明, 其包括甘露糖、葡萄糖和阿拉伯糖, 并带有微量半乳糖醛酸, 包含(1→4)连接的β-D-吡喃半乳糖基残基和(1→4)连接的β-D-吡喃葡萄糖基残基。

多糖是复杂生物大分子, 不同单糖的组成和连接方式决定了多糖结构解析的难度, 并与多糖药理活性密切相关。至今为止, 铁皮石斛多糖没有形成统一的质量标准, 具体的构效关系也不甚清晰。目前药理研究采用的大多为铁皮石斛水提物或多糖粗提物, 一定程度上阻碍了多糖发展成为候选药物的进程, 因此采用新的方法探索多糖的结构组成, 明确构效关系, 并及时制定质量标准将对研究铁皮石斛药理活性和作用机制具有重要意义。

铁皮石斛在传统应用中具有益胃生津和厚肠胃作用。铁皮石斛多糖粗提物对亚硝基胍(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)诱发的大鼠慢性萎缩性胃炎具有良好的治疗效果, 增加模型大鼠的腺体数量和腺体厚度、减轻胃组织增生和肠上皮化生状态[22, 23]。Wu等[24]测评了铁皮石斛粗多糖对阿司匹林刺激的永生化胃黏膜上皮细胞GES-1炎症因子分泌的影响, 结果表明, 与模型组相比, 铁皮石斛多糖各组的白细胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)和肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)的释放量明显减少, 并呈现明显的剂量依赖性。Zeng等[25]发现铁皮石斛的一种O-乙酰化葡甘露聚糖对过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)损伤的人胃黏膜上皮细胞HFE145具有保护作用。铁皮石斛多糖预处理可以显著降低活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平, 并明显减少诱导早期及晚期的细胞凋亡, 改善细胞核形态。为研究铁皮石斛的益胃作用, Xie等[26]制备了铁皮石斛水提取物和醇提取物的高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)指纹图谱, 结果表明, 有利于预防实验性胃损伤的铁皮石斛化学成分主要在水提取物中。

对于肠道炎症的治疗, 铁皮石斛O-乙酰化葡甘露聚糖能够改善葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium salt, DSS)诱导的小鼠结肠炎, 可降低死亡率、减少肠道出血、增加粪便含水量、有效减轻结肠损伤并降低脾脏指数[27]。另外, 铁皮石斛多糖在降低促炎细胞因子白细胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-6、IL-18、TNF-α和干扰素γ (interferon-gamma, IFN-γ)产生的同时, 还剂量依赖性地增加抗炎细胞因子IL-10的产生, 使促炎/抗炎细胞因子的比例显著降低[14]。另有研究证实[15], 铁皮石斛O-乙酰化葡甘露聚糖在BALB/c小鼠中可显著抑制氧化偶氮甲烷(azoxy-methane, AOM)/DSS诱导的结肠癌的发生和进展, 明显减少模型小鼠的便血量, 降低死亡率, 并改善结肠损伤。铁皮石斛多糖(50 mg·kg-1)能够显著抑制癌前病变、降低邻近结肠部位肿瘤的产生和炎性细胞浸润, 在癌前组织和癌变组织中都可显著改善结肠上皮损伤和隐窝结肠异型增生, 继而改善肠道的屏障功能[15]。

目前研究发现[14, 15, 22-24], 铁皮石斛多糖改善胃肠炎涉及的相关信号通路主要有:核转录因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB)、Janus激酶/信号转导与转录激活子(the Janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions, JAK/STAT)和NOD样受体蛋白3 (NLR family pyrin domain containing 3, NLRP3)炎症小体信号通路。NF-κB介导先天免疫细胞和淋巴T细胞的增殖分化, 是重要的炎症信号通路分子开关, 过度活化的NF-κB会导致多种炎症因子的产生及相关基因和蛋白表达的失调[28]。针对NF-κB信号通路的机制研究发现[23, 24], 铁皮石斛多糖可下调增殖细胞核抗原蛋白(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)和TNF-α的mRNA水平及蛋白表达量, 剂量依赖性地降低NF-κB抑制蛋白α (inhibitor α of NF-κB, IκBα)和NF-κB p65的磷酸化水平, 抑制NF-κB活化。JAK2/STAT3信号通路是多种细胞因子和生长因子在细胞内传递信号的共同途径, 该通路的失调会促进多种肠道炎症甚至肿瘤的发生和发展。铁皮石斛多糖可逆转慢性萎缩性胃炎大鼠的病理状态可能是通过抑制上游蛋白激酶JAK2的活化进而抑制STAT3的活化而实现的[22]。NLRP3炎症小体可被多种病毒、细菌、内源性和外源性刺激物激活, 触发caspase-1对pro-IL-1β和pro-IL-18的加工处理, 从而使这些细胞因子活化并分泌, 介导炎症反应的发生[29]。铁皮石斛多糖能够显著降低结肠炎小鼠结肠组织和NCM460细胞中NLRP3、IL-1β和IL-18的mRNA水平和蛋白表达量, 并抑制NLRP3上游激酶β-arrestin1的表达, 提示铁皮石斛多糖可能通过下调β-arrestin1的表达阻断NLRP3信号通路的激活以发挥抗炎作用[14, 27]。另外, 铁皮石斛多糖抑制AOM/DSS诱导的结肠癌小鼠病程发生和进展的机制可能与增加结肠癌小鼠癌前结肠组织和癌变结肠组织中紧密连接蛋白1 (tight junction protein1, TJP1)的表达量相关, 并与免疫细胞中表现出减少细胞毒性T淋巴细胞CD8+表面程序性死亡受体1 (programmed cell death protein 1, PD-1)的表达有关, 提示铁皮石斛多糖可能通过增强肿瘤微环境中T细胞的抗肿瘤免疫反应来发挥作用[15]。

铁皮石斛多糖可刺激ICR小鼠骨髓细胞增殖[20], 灌胃铁皮石斛多糖粗提物(2.0 g·kg-1·d-1) 3天后, 骨髓细胞增殖率为35.2%, 7天后提高至71.7%, 通过测定派伊尔淋巴结和肠系膜淋巴结中的细胞因子水平, 发现铁皮石斛O-乙酰化葡甘露聚糖可显著增加IFN-γ和IL-4分泌量, 并增加回肠组织中免疫球蛋白A的数量[20], 提示铁皮石斛多糖是潜在造血生长因子调节剂。铁皮石斛多糖不同分级组分均可显著提高小鼠胸腺指数, 促进IFN-γ和TNF-α分泌, 进而提高小鼠免疫功能[30]。铁皮石斛水煎液和多糖粗提物均可不同程度提高免疫低下小鼠的溶血素光密度值和炭粒廓清指数, 铁皮石斛水煎液还可促进小鼠脾脏T淋巴细胞的增殖, 从而参与机体的细胞免疫过程[31, 32]。铁皮石斛也可显著提高小鼠脾脏B淋巴细胞的增殖, 并协同脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)促进正常小鼠脾脏B淋巴细胞的增殖, 从而参与机体体液免疫[33]。铁皮石斛多糖对细颗粒物(fine particulate matter, PM2.5)引起人外周血淋巴细胞的DNA损伤具有显著修复作用, 并可抑制炎症因子分泌[34]。纯化的铁皮石斛O-乙酰化葡甘露聚糖可以刺激人单核细胞白血病细胞THP-1产生细胞因子TNF-α和IL-1, 显著促进BALB/c小鼠脾细胞增殖, 提高杀伤细胞活力, 提高小鼠单核巨噬细胞/白血病细胞RAW264.7细胞的吞噬活力, 增加小鼠脾脏以及RAW264.7细胞中炎症因子的产生[35-37]。Huang等[18]研究发现, 铁皮石斛多糖可促进环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠体内脾淋巴T细胞和B细胞的增殖, 并且可以帮助平衡T淋巴细胞亚群, 使免疫抑制小鼠脾脏中CD4+/CD8+的比率接近正常水平。

目前对于铁皮石斛多糖调节免疫的机制研究较少, 有研究发现, 多糖可能附着在RAW264.7细胞表面或进入细胞内部发挥作用, 这与以往对多糖的理解不同[35]。He等[36]对铁皮石斛多糖发挥免疫调节的机制进行研究, 提出从铁皮石斛中提取纯化的O-乙酰化葡甘露聚糖可能通过Toll样受体4 (Toll-like receptor 4, TLR4)信号通路介导NF-κB诱导免疫反应[38]。

铁皮石斛养阴且生津止渴, 是中药组方中治疗消渴症的重要组分。消渴症具有多饮、多食、多尿、身体消瘦等特征, 现代医学定义的糖尿病即属于中医消渴症范畴。多项研究发现[39-43], 铁皮石斛水提物及多糖对不同的糖尿病模型小鼠及体外细胞模型的病理状态均具有改善作用。铁皮石斛水提物可以改善2型糖尿病MKR模型小鼠的胰岛素抵抗及棕榈酸和葡萄糖诱导的小鼠胰岛β细胞株MIN6细胞的胰岛素抵抗, 在与阳性药二甲双胍联合用药后, 其作用更加明显[39, 40]。Zhang等[41]发现铁皮石斛多糖粗提物可改善高糖刺激导致的人脐静脉内皮细胞的细胞形态改变, 增强细胞活力, 并抑制细胞凋亡。铁皮石斛多糖对四氧嘧啶和链脲佐菌素(streptozocin, STZ)诱导的糖尿病小鼠的高血糖、胰岛素抵抗和血脂异常的症状均具有显著改善作用, 并可降低肝脏和肾脏中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、丙二醛(malonaldehyde, MDA)和L-谷胱甘肽(L-glutathione, GSH)的水平[42, 43]。

糖尿病对人体健康的更大危害在于其并发症, 对糖尿病的防治不仅在于有效降糖, 还在于如何缓解相关并发症的产生和发展, 这与中医药治疗的整体观契合。对铁皮石斛的研究数据表明[44-47], 作为传统消渴症的适用中药, 铁皮石斛不仅对各类糖尿病体内外模型表现出降糖效果, 还对糖尿病引起的并发症有较好的治疗作用。铁皮石斛多糖通过降低乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、血清总胆固醇(serum total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)和MDA含量, 并同时增加总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)水平, 可改善糖尿病小鼠心肌并发症[44]。通过改善高血糖导致的视网膜病变大鼠视网膜及血清内IL-6和TNF-α的含量, 增强大鼠视网膜Müller细胞活力, 防治糖尿病导致的眼部并发症[45, 46]。

关于铁皮石斛降血糖和改善糖尿病并发症的机制研究主要集中于对磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases, PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(protein-serine-threonine kinase, AKT)信号通路的研究。PI3K/AKT信号通路参与调节细胞的增殖、分化、凋亡等生命活动, 多种慢性病如糖尿病、心血管系统疾病等与PI3K/AKT通路密切相关, 激活该通路可以改善糖代谢异常、增加胰岛素的敏感性、改善能量代谢紊乱、减轻慢性炎症反应等[47]。铁皮石斛水提物能明显提高MIN6细胞和STZ诱导的糖尿病小鼠磷酸化胰岛素受体底物-1 (phosphated insulin receptor substrate-1, p-IRS-1)、磷酸化磷酯酰肌醇-3激酶(phosphorylated phosphatidylinositol-3-kinase, p-PI3K)和磷酸化AKT蛋白的表达水平, 降低磷酸化糖原合成酶激酶3β蛋白(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)的表达水平, 提示铁皮石斛可能通过PI3K/AKT通路促进糖原合成并参与调节维生素D活性, 以改善胰岛素抵抗[40, 43]。代谢组学实验结果显示, 铁皮石斛多糖预处理可显著增加STZ处理小鼠的肝脏和血清中的柠檬酸盐、谷氨酰胺、肌酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺和牛磺酸水平, 表明铁皮石斛多糖对糖尿病的预防作用可能与肝糖原和牛磺酸的增加以及能量和氨基酸代谢的上调有关[48]。

氧化应激过程在多种心血管疾病的病理学进程中起重要作用, 是心肌细胞凋亡的关键因素之一[49]。经提取纯化的铁皮石斛多糖在体外表现出对1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)的清除作用, 具有显著的体外抗氧化活性[21]。Zhao等[49]研究发现, 铁皮石斛多糖对H2O2诱导的大鼠心肌细胞H9c2的氧化应激具有保护作用, 可抑制H9c2细胞凋亡、显著降低MDA水平、增加SOD活性并抑制细胞内ROS的产生。Zhang等[50]也发现, 铁皮石斛多糖预处理提高了H2O2诱导的H9c2细胞的存活率, 减少脂质氧化损伤, 并可降低线粒体膜电位。铁皮石斛多糖对衰老相关疾病具有显著的改善作用, 在卵巢切除诱发雌激素缺乏的小鼠学习记忆障碍模型和D-半乳糖导致的认知能力下降模型中, 铁皮石斛多糖可改善模型小鼠的认知障碍症状, 同时海马神经元的苏木精-伊红染色、尼氏染色及生化分析实验结果表明铁皮石斛多糖改善了神经损伤[51]。在快速老化小鼠模型SAMP8中, 铁皮石斛多糖能够显著抑制SAMP8小鼠海马小胶质细胞激活强度, 从而减轻认知障碍症状[52]。对卵巢早衰小鼠灌胃铁皮石斛多糖后, 其卵巢和子宫/体重参数可降低至正常水平, 卵泡细胞的数量也明显增加, 提示卵巢病理损害减轻[53], 但相关机制研究仍然缺乏, 亟需深入研究。

人体肠道中充满了肠道微生物, 其构成复杂庞大的肠道微生物群落, 即肠道菌群, 由超过100万亿个细菌、1 000多个菌种组成。研究显示, 肠道菌群作为宿主的重要“器官”, 在维护机体健康中发挥着不可或缺的作用[54]。

多糖在中药工业生产中常被视为杂质予以剔除, 但越来越多的研究发现, 人类肠道细菌编码数千种碳水化合物活性酶(carbohydrate-active enzymes, CAZy), 可代谢多糖等大分子化合物, 进而生成具有不同特征的新代谢产物, 有利于调节肠道菌群的组成, 减轻相关的病理症状[55]。例如燕麦β-葡聚糖和灵芝多糖均被证实能提高大/小鼠肠道微生物丰度, 可加强肠道屏障并改善大/小鼠的病理状态[5, 6]。

目前对多糖调节肠道菌群发挥药理活性的机制研究表明, 多糖经肠道微生物发酵降解后产生大量短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs), 可发挥抗炎、抗菌、维持能量代谢平衡等多种作用[56]。SCFAs的生物学效应主要涉及2个方面:抑制组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)活性和参与G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)信号转导通路[57]。当巨噬细胞、外周血单核细胞、中性粒细胞和调节性T细胞等多种免疫细胞中的HDACs被抑制后, 可显著降低细胞促炎因子IL-6和IL-8等产生, 表现出明显抗炎效应。SCFAs与GPCRs的结合能够诱导肠内分泌细胞肠肽和胰高血糖素样肽1的释放, 刺激脂肪组织产生瘦素, 进而调节肠道免疫细胞的稳态[58]。

由于铁皮石斛多糖存在吸收较差、利用率低的问题, 因此越来越多的研究者开始尝试立足于肠道菌群分析来阐述铁皮石斛发挥药理活性的物质基础和机制[8-10]。研究表明铁皮石斛多糖具有改善便秘小鼠便秘症状、肠道细菌多样性和相关酶活性的作用, 铁皮石斛多糖灌胃连续给药7天后, 可增加肠道细菌总数、增加乳酸杆菌菌落数、降低大肠埃希菌菌落数和双歧杆菌菌落数, 并对淀粉酶、木聚糖酶和纤维素酶活性具有正向调节作用[8, 9]。多种疾病的发生与肠道菌群调节紊乱关系密切, 例如糖尿病和肥胖等慢性代谢性疾病的发生和发展均伴随着肠道菌群的紊乱[10]。铁皮石斛水提物可以恢复糖尿病小鼠肠道菌群的数量和种类, 同时降低血清TC、TG、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)含量, 改善体内脂质代谢, 减少动脉血管因脂代谢异常造成的炎症反应[10]。但目前对于铁皮石斛多糖与肠道菌群的相互作用研究仍存在许多问题, 相互作用等机制研究尚欠缺, 铁皮石斛中是否存在独特结构的多糖通过影响肠道菌群进而改变机体生理状态的研究也尚未阐明。

铁皮石斛多糖的药理活性广泛, 具有改善胃肠炎症、降血糖、调节免疫等作用, 但鉴于多糖分子量大, 无法进行静脉、肌肉和皮下的注射使用, 口服后在体内亦很难被肠道直接吸收, 作者认为上述研究的体内实验具有参考价值及可信度。目前对SCFAs等信号分子的深入研究为揭示铁皮石斛多糖通过调节菌群发挥多种药理活性的机制提供可能, 但对铁皮石斛多糖的研究仍存在较多局限, 例如大部分研究所用的铁皮石斛多糖多为粗提物, 未分离出纯化的均一多糖且缺乏全面的化学分析, 这也是影响中药标准化的重要因素之一。因此, 在今后的工作中通过采用具有高度选择性和敏感性的色谱、光谱技术对多糖组分进行化学表征和标记, 并完成定性和定量测定对推动多糖作为候选药物的进程是必不可少的。

多糖和肠道菌群相互作用的研究仍处于起步阶段, 现阶段的研究发现, 多糖对肠道菌群的调节作用及肠道菌群介导的多糖对机体的改善作用提示肠道菌群可能是多糖发挥药效作用的潜在靶点。了解肠道菌群与多糖之间的相互作用对基于大分子复杂化合物的药物发现将具有重要意义。

作者贡献:孙乐、吴崇明和郭顺星负责综述的撰写、相关文献的资料收集; 孙乐和吴崇明负责文章作图; 陈晓梅参与了部分内容的撰写和文献整理; 全体作者都阅读并同意最终的版本。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。