北京大学第一医院肿瘤转化与研究中心，北京 100034

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癌症是世界性的医疗健康挑战。在中国，癌症的五年生存率仅有40.5%，严重威胁人民健康，并造成社会发展的沉重负担[1]。尽管靶向治疗和免疫治疗给部分患者带来一线生机，然而，肿瘤的精准诊疗受限于明确的药敏标记物[2]。长期以来，肿瘤的药物筛选常依赖于传统的二维培养及患者来源的肿瘤异种移植(patient-derived xenograft，PDX)模型。细胞系作为癌症研究中最早及最为普遍应用的模型，具有可操作性高、培养周期短及高通量的特点[3]，然而细胞系并不能很好地模拟肿瘤的三维生长环境，也缺乏肿瘤的异质性特征[4]。PDX模型直接来源于患者，能准确反映肿瘤的遗传异质性，可保留原始肿瘤的结构、细胞组成及分子特征，然而，PDX模型成本高、耗时长等缺点限制了其在肿瘤精准治疗中的广泛应用[5]，因此，在肿瘤研究领域，长期以来科学家们都致力于开发更好的三维研究模型。2009年，Sato等[6]培养Lgr5阳性的干细胞，通过构建三维体系，添加R-spondin、Noggin及表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)等，在基质胶中培养出绒毛样上皮结构[6]，至此肠道类器官(organoid)成功问世。类器官集合了以上几种培养方式的优点，在肿瘤研究方面具有独特的优势。类器官既可以保留原始肿瘤的异质性[7]，而且允许不同来源的肿瘤样本(如来源于穿刺活检、胸腔积液、循环肿瘤细胞)的扩增，可以实现对肿瘤不同分期的建模。与二维细胞培养相比，肿瘤类器官具有基因组和转录组的稳定性；肿瘤细胞类器官培养后植入小鼠体内，建模速度和成功率均高于PDX模型[8]。此外，类器官技术可以实现对患者的癌和癌旁或正常组织分别建库，进一步对患者肿瘤进展及药物筛选进行深入研究[9]。

自2009年肠道类器官成功“问世”以来，类器官培养技术取得了长足的进步，且逐步发展为生物医学领域最具突破性的前沿技术之一。在之后的5年内，结肠和小肠[10-11]、视网膜[12]、大脑[12]、肝脏[13]、胃[14]和乳腺[15]等人源类器官相继建立。类器官技术被The Scientist评为2013年度十大科研突破之一。2017年，类器官技术被Nature Methods杂志评选为“年度方法”；Science杂志将类器官技术评选为2018年度重大突破；2019年6月7日，Science推出类器官特刊，类器官被作为封面图片。2021年类器官被列入中国“十四五”重点研发计划专项，其重要性得到进一步体现。目前，人源类器官被公认为生物医学研究的重要工具，相关研究已经开始在许多国家蓬勃开展。全球有100多个实验室正在使用类器官研究癌症和其他疾病，且建立了一些小型类器官样本库，未来有望引起全球更大范围的研究热潮[16]。在国家大力支持下，中国在该领域的研究虽起步较晚但发展迅猛。近年来，国家自然科学基金委员会资助相关项目315项，资助经费近1亿元人民币。2021年文献发表量占全球当年总量18.2%，仅次于美国，位列第二。

类器官可由胚胎干细胞、成体干细胞或诱导干细胞经过三维培养分化、发育而成。在体外环境下，通过加入基质胶及多种细胞因子，干细胞以与体内相似的方式实现自我组建。类器官可高度模拟原位组织的生理结构、功能以及发育和分化过程，可广泛用于药物开发、疾病建模、癌症研究、发育生物学、再生机制、精准医疗和器官移植等研究领域[17]。

类器官的生长主要依赖于多种细胞因子的支持及基质胶提供的三维环境。这些细胞因子的类别主要包括：促进细胞生长、分化相关通路的激活剂、抑制剂以及激素; 促进细胞增殖的细胞因子; 提高类器官培养成功率所添加的细胞因子等。2009年，Sato等[10]通过在基础培养基中添加Wnt通路激动剂R-spondin、转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)抑制剂Noggin、EGF等，成功培育出具有隐窝和绒毛样的类小肠结构[6]。该培养方案为类器官技术的发展打下了良好的基础。在此基础上，该实验室通过改进配方，进一步添加烟酰胺、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)抑制剂A-8301、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)和p38抑制剂SB202190等，成功建立了人结直肠肿瘤类器官体系。在此基础上，多个实验室通过增减不同细胞因子，多种组织的类器官体系相继研发。在三维体系的构建方面，初期多使用细胞外基质胶作为立体支架[18]，然而，基质胶的培养可能通过限制类器官与周围微环境之间的气体和代谢物交换来抑制类器官的生长和成熟。因此，基质胶逐渐被包含较大空腔的海绵状[19]或纤维网状支架[20]取代。Robertson等[21]使用肝脏的内部血管网络作为支架，更好地促进了营养物质在类器官中的运输，显著提高了类器官的体外存活率。这些突破性的新型支架，极大地推动了类器官技术的不断发展。

为了更好地保留患者的异质性、人体肿瘤与免疫微环境，相继建立了多种类器官培养体系，由最基础的类器官包埋法或液滴法，进而衍生出气液平面法、共培养法等。近年来，多项研究通过holistic法[22-23]或reductionist法[24]成功构建了肿瘤免疫类器官体系。Neal等[22]通过holistic法报道了一种气液平面类器官模型，该模型包含上皮和基质隔室，以及特定的肿瘤浸润淋巴细胞。除了基础培养基外，还添加了额外的T细胞激活剂，例如白介素2(inteleukin-2，IL-2)，以支持免疫细胞的生长。因此，CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞、自然杀伤(natural killer，NK)细胞和自然杀伤T(natural killer T，NKT) 细胞等多种类型的免疫细胞，可在此系统中存活数天[22]。在reductionist体系中，类器官可取自患者手术标本或活检标本，与来自同一患者外周血的免疫细胞共培养，从而实现长期共培养(图 1)，因此，基于类器官系统研发的多种体系，可满足不同的类器官生长和扩增需求，并为肿瘤微环境研究，以及肿瘤免疫个体化治疗提供了良好的研究平台。

肿瘤免疫共培养的类器官系统

在holistic方法中，肿瘤细胞悬液培养在气液平面中，该悬液中包含所有类型的肿瘤细胞、内源性免疫细胞和成纤维细胞等，以产生肿瘤免疫类器官。在reductionist方法中，肿瘤细胞悬液主要为肿瘤细胞，之后与来自同一患者外周血的自体免疫细胞共培养，以促进肿瘤反应性T细胞的连续扩增。NK细胞, 自然杀伤细胞。

基于类器官可以高度保留原始组织的结构特点及基因组特征，类器官在多种癌症的研究中已经成为必不可少的三维模型。类器官在癌症研究领域中的研究主要包括以下两方面：(1)从患者的标本中，包括手术标本、穿刺标本、循环血细胞，甚至腹水标本中直接提取肿瘤细胞，建立肿瘤类器官生物库，可直接用于患者的肿瘤进展、药物筛选及精准医疗研究(图 2)。(2)在正常组织中，通过CRISPR-Cas9等基因编辑方法，敲入或敲除特定癌基因，研究该基因对肿瘤的起始、进展、耐药驱动效果，这对该基因异常表达或突变的人群至关重要，也满足了个体化治疗的需求(图 2)。下面，我们对国内和国际上现有的肿瘤类器官生物库展开具体论述，并对基因编辑类器官展开详细的分析探讨。

类器官在癌症研究、药物筛选和精准医学领域的应用

从患者的正常组织培养类器官进行基因编辑可形成肿瘤类器官，也可取样自患者的肿瘤组织建立类器官，进而建立肿瘤类器官生物库。肿瘤类器官生物库为研究肿瘤进展、药物筛选及精准诊疗提供了良好的平台。

2014年，Gao等[25]通过组织活检从前列腺癌转移病灶中培养了6例类器官细胞系，从循环肿瘤细胞中培养了1例类器官品系，培养成功率为15%~20%。这个小型前列腺癌生物库涵盖前列腺癌的各种亚型，如高级别腺癌、黏液性腺癌、广泛鳞状分化的腺癌和筛状生长的腺癌，与原始患者的病理类型与诊断标记物是一致的。此外，转录组和蛋白质组分析表明，这些类器官品系也保留了患者前列腺癌的多样性。

2009年Sato等[6]首次建立的小肠类器官，为结直肠癌类器官技术奠定了良好的基础。同年，Barker等[26]也报道了通过小鼠的肠腺瘤组织，体外成功建立囊性器官样结构的方法。之后，van de Wetering等[27]建立了20例结直肠癌患者的22例肿瘤类器官，及19例癌旁类器官。建库成功率为90%，类器官冻存-复苏成功率高达80%。患者的特异形态学组织，如上皮的囊性与实性组织得以保留，类器官中的诊断标记物Ki-67、OLFM4和KRT20与患者是一致的。为了更好地培养不同病理类型的结直肠癌类器官，Fujii等[8]改进了培养基中的生长因子配方，调整了Wnt通路激活剂和其他抑制剂，成功建立了55例结直肠癌类器官品系，涵盖增生性息肉、锯齿状腺瘤/息肉、早期肿瘤、晚期肿瘤和转移性癌，所有类器官均可保留原始肿瘤的病理学结构特征。该不同亚型类器官建库的培养方法也陆续为后续研究采纳，其他癌种不同病理类型的类器官也在国际上陆续建立。

乳腺癌包括多种病理亚型，是一种异质性较强的癌症。Sachs等[15]从155例乳腺癌标本中建立了95例乳腺癌类器官，建库成功率>80%。该类器官生物库包括了乳腺癌的不同类型、分期、分级及与患者一致的雌激素、孕激素受体状态。该类器官生物库的病理类型分布，与乳腺癌的流行病学也是一致的，即包括50%~80%的浸润性导管癌和5%~15%的浸润性小叶癌。此外，全基因组测序和转录组测序表明，即便在长期培养后，类器官的拷贝数变异和基因表达谱也与亲本肿瘤高度相似。

Yan等[28]报道了34例胃癌患者的类器官生物库的建立，共涵盖原发性肿瘤、淋巴结转移灶及患者的非肿瘤组织共63例，其中非肿瘤组织类器官建库成功率>90%，肿瘤类器官建库成功率>50%。该生物库包含了胃癌的大部分病理类型，包括微卫星不稳定型、Epstein-Barr病毒型、弥漫型及肠型。蛋白组学分析也显示了肿瘤标志物(如人表皮生长因子受体2和成纤维细胞生长因子受体2)在肿瘤类器官中的过度表达。同年，Vlachogiannis等[29]通过Ⅰ期、Ⅱ期临床试验的71例患者的110例转移性胃肠癌标本创建了类器官生物库，建库成功率为70%。Vlachogiannis等[29]揭示了这些肿瘤类器官的表型和基因组学特征，此外，重点研究了该类器官在药物筛选中的应用。该研究证实了通过类器官预测患者的临床药敏反应的可行性，为后续类器官在个体化医疗中的应用铺平了道路。

Lee等[30]从16例膀胱癌患者中建立了22例膀胱癌类器官品系，建库成功率为70%。该类器官生物库保留了多种膀胱癌病理类型，其中1例类器官显示出罕见的鳞状细胞癌特征。此外，该团队通过长期连续培养，建立了患者来源类器官、类器官-小鼠移植瘤、小鼠移植瘤来源的类器官等多种模型，并通过全基因组及外显子测序，揭示了类器官本身的进化特征，为研究肿瘤的异质性进化打下了良好基础。

胰腺癌往往表现为高度的异质性和恶性表型，这为类器官生物库的建立增加了一定难度。Boj等[31]首次通过小鼠胰腺癌组织、人源胰腺癌组织及人源非肿瘤胰腺组织建立了类器官模型，这些模型均表现出胰腺或胰腺癌的特异性结构特征。该方法的建立为后续胰腺癌大规模建库提供了基础的培养方法。随后，Seino等[32]通过39例外科手术、细针抽吸和腹水标本建立了人类胰腺癌类器官生物库，明确了通过改进Wnt或R-spondin配方，培养不同类型的胰腺癌类器官的具体方法。团队还收集培养了胰腺癌的肿瘤相关成纤维细胞，为类器官提供Wnt分泌蛋白，为后续肿瘤-成纤维类器官共培养体系提供了思路。

卵巢癌是一种女性高发、具有多种病理亚型且异质性较强的癌症。Kopper等[33]从32例患者中建立了56例卵巢癌类器官品系，建库成功率为65%，该生物库包括了卵巢癌所有的病理类型，包括浆液性交界性肿瘤、黏液性交界性肿瘤、浆液性癌、黏液性癌、子宫内膜样癌和透明细胞癌。这些类器官的管腔结构与患者也是一致的。在基因组层面，类器官也较好地保留了患者内和患者间的异质性特征。

胶质母细胞瘤是成人中最常见的脑肿瘤，具有高度侵袭性，并在靶向和免疫治疗中表现出较强的耐药性[34]，Jacob等[7]从53例胶质母细胞瘤患者中建立了70例类器官品系，转录组测序、全外显子组测序和单细胞转录组测序表明，胶质母细胞瘤类器官很好地保留了肿瘤内和肿瘤间的异质性。在此基础上，团队将胶质母细胞瘤类器官与嵌合抗原受体T (chimeric antigen receptor T，CAR-T) 细胞共培养，探索了CAR-T细胞治疗反应，揭示了肿瘤类器官在免疫治疗中的应用潜力。

Broutier等[35]于2017年建立了原发性肝癌类器官，包括来自8例手术切除的肝细胞肝癌、肝内胆管癌、混合癌三种亚型。在此基础上，Nuciforo等[36]使用8例肝细胞癌患者的10例穿刺标本，及3例胆管癌患者的穿刺标本，建立了13例类器官品系，为类器官的活检标本建库提供了新思路。2019年，Li等[2]通过对同一患者多点取样的方法，在2例肝细胞癌患者和3例胆管癌患者中，共取样27例，建立类器官生物库，并对该生物库进行129种美国食品和药物管理局批准的抗肿瘤药物筛选，直接揭示了多点取样类器官的药敏异质性。随后，Zhao等[37]通过建立数例肝细胞癌类器官、Yuan等[38]通过建立数例胆管癌类器官，进一步揭示了类器官的肿瘤异质性，及类器官在药物筛选和精准医学中的应用。然而，目前尚无报道大规模肝癌、胆管癌的类器官生物库。

除了对肿瘤患者类器官直接取样建库外，多个团队还通过对正常细胞进行基因编辑，构建肿瘤类器官。该类型的类器官，可以更好地研究肿瘤的起始、进展，以及通过对特定基因进行编辑，可以更好地围绕该基因进行药物筛选，研究肿瘤的耐药驱动。从而实现特定人群的精准医学指导。例如，Huang等[39]通过三维培养人类多能干细胞，成功建立了KRAS、TP53突变的人胰腺癌类器官，用于研究胰腺癌发生发展的机制，并进行药物筛选和精准医学方案初步探讨。此外，Matano等[40]、Drost等[41]通过CRISPR/Cas9技术在结肠细胞中编辑APC、SMAD4和PIK3CA以构建结直肠癌模型，借此研究了结直肠癌恶性表型的发生发展进程。2019年，Sun等[42]利用hiHep系统，通过细胞自我组装在体外构建了人源肝类器官模型，并通过向hiHep肝类器官中引入相关的致癌因子，探究其在肝癌发生发展中的作用。发现c-MYC的引入缩短了线粒体和内质网间的距离，影响其有氧呼吸，诱导了肝细胞癌的发生，并证明RAS可诱发肝细胞转化为肝内胆管癌，首次在人源模型中证明了肝细胞可以作为肝内胆管癌的起源。未来，科研工作者可利用此模型，通过相继引入不同的致癌因子及添加多种微环境因素，如免疫细胞、基质细胞等，可进一步模拟肿瘤的早期发生及发展过程。

近年来，相比于传统的二维细胞系模型及PDX模型，类器官逐步显示出在药物筛选和精准医疗中的独特优势。类器官可以很好地保留患者的异质性，使得其临床筛药功能逐渐被更多的研究人员认可。van de Wetering等[27]发现即使是来自同一患者，都携带BRAF V600E突变的类器官，其不同类器官品系药敏反应也不相同，提示了基于肿瘤异质性进行药敏筛选的必要性。Sachs等[15]发现，在HER2过表达的情况下，乳腺癌类器官对阻断HER2信号通路的药物敏感。此外，高表达BRCA1/2的乳腺癌类器官对ADP-核糖聚合酶抑制剂敏感，而低表达BRCA1/2的乳腺癌类器官则对ADP-核糖聚合酶抑制剂耐药，提示类器官转录组水平的基因表达，同样可作为药敏筛选的重要依据。Broutier等[35]使用肝癌类器官筛选了29种抗肿瘤的化合物，包括临床中正在使用或正在开发的药物。发现携带突变CTNNB1的肝细胞癌类器官对抑制剂LGK974耐药，而Wnt通路依赖的类器官对LGK974敏感, 且野生型KRAS类器官对EGF受体抑制剂AZD8931敏感，而KRAS突变类器官对其耐药。上述研究均说明基于类器官的肿瘤异质性进行药敏筛选的必要性。

肿瘤类器官可用于患者的药敏预测，为精准医学治疗做出重要提示。Sachs等[15]在接受标准临床治疗的患者中，比较了乳腺癌类器官和患者对他莫昔芬的反应，发现类器官的体外药物反应与相应患者的药物反应是一致的，提示类器官在预测患者药物反应中的潜在用途。Vlachogiannis等[29]在临床试验中，进一步比较了肿瘤药物治疗的类器官与相应患者的反应，类器官在预测患者对靶向药物或化疗药物的反应方面，表现出100%的敏感度、93%的特异性、88%的阳性预测率及100%的阴性预测率，证实了类器官在精准诊疗中预测药物反应的能力。

类器官也可用于大规模药物和毒理学筛选。Skardal等[43]介绍了一种类器官芯片平台。在这个系统中，多个癌细胞形成的类器官分别被独立封装在Matrigel中，而在其他腔室中，成纤维细胞也培养在海藻酸盐凝胶中，特定腔室之间有液体可以流通，较好地模拟了肿瘤微环境。这种类器官芯片与微流控技术的结合，允许类器官大批培养及高通量药敏测试，为个体化肿瘤微环境的模拟及药物筛选提供了良好平台。

与传统的二维细胞系及免疫缺陷小鼠模型相比，类器官可为肿瘤免疫精准治疗提供线索[22]。肿瘤的免疫疗法在近些年应用广泛，虽取得了一定的进步，然而总体有效率不高，仅对部分患者有效，免疫治疗仍亟需精准医学标准[22]。随着肿瘤免疫共培养类器官系统的改进，Jacob等[7]将胶质母细胞瘤类器官与CAR-T细胞共培养，以期与表达表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receptor variant Ⅲ，EGFRvⅢ)的细胞发生特异性反应。通过测试T细胞的增殖，及肿瘤细胞在EGFRvⅢ存在时的死亡，团队证实了类器官在快速测试内源性靶标及免疫治疗方面的作用。此外，类器官也用于研究抗程序性细胞死亡蛋白-1 (programmed death-1, PD-1)治疗的效果。Neal等[22]建立了20例肿瘤免疫类器官，并测试了治疗性PD-1阻断抗体纳武利尤单抗的效果。结果显示，纳武利尤单抗在CD3+淋巴细胞浸润的类器官中，显著诱导了干扰素-γ(interferon gamma，IFNG)、穿孔素1(perforin 1，PRF1)和颗粒酶B(Granzyme B)，在体外水平显示出免疫检查点的功能性抑制。这与临床试验中的个体化抗PD-1的效果是一致的。

患者来源的类器官，也可用于追踪肿瘤治疗前后的耐药演进。Vlachogiannis等[29]利用瑞戈非尼治疗前后的直肠癌患者的肝转移组织建立了类器官，以此类器官建立了小鼠移植瘤模型，并用瑞戈非尼对小鼠进行治疗。对小鼠肿瘤的CD31免疫组化染色显示，未经瑞戈非尼治疗的类器官小鼠模型中，微血管系统在瑞戈非尼处理下显著减少，而经过瑞戈非尼治疗的类器官小鼠模型中，微血管系统对瑞戈非尼产生耐药，对后续瑞戈非尼的处理无响应。这与临床上患者逐渐产生的瑞戈非尼耐药情况是一致的，揭示了类器官在预测肿瘤耐药演进过程中的关键作用。

在类器官对精准医学的指导中，除了通过药物筛选精确找出对肿瘤疗效显著的药物，更重要的是可以通过患者的癌旁或正常组织建立类器官，进行药物测试，避免药物对正常组织的额外伤害。Drost等[17]建议为患者培养肝细胞类器官用于检测肝毒性，防止药物对肝脏损伤过重对患者健康情况造成威胁。药物肾毒性是住院患者治疗失败的另一个重要原因[44]。通过使用类器官来检测顺铂在肾脏近端和远端小管中的毒性，Morizane等[45]在肾毒性研究方面取得了重要突破。此外，源自诱导多能干细胞的心脏类器官也已被用于研究心脏毒性[46-47]。这些类器官，为研究抗癌药物在个体化医疗中的毒性提供了很好的线索。

尽管在众多癌症研究模型中，类器官独具优势且发展迅猛，然而，目前类器官技术仍存在一定短板。例如，与二维细胞系相比，部分类器官显示出局限的传代与冻存-复苏率，尤其是免疫类器官，其培养时间更短，在此情况下，患者做药物筛选的次数也相对有限。此外，如何调整配方，既保证肿瘤类器官中存在一定的成纤维细胞，来更好地模拟肿瘤微环境，又要避免成纤维细胞过度生长压制肿瘤细胞的比例，目前也尚无明确的方案。在类器官细胞的种类上，目前还不能在类器官中成功地引入血管系统[48]，类器官在肿瘤血管生成领域的研究仍属空白。在类器官的成本方面，由于加入了大量的细胞因子和基质胶，使得类器官成本数倍甚至数十倍于传统的二维细胞培养体系。Gjorevski等[49]用人工合成的基质胶代替小鼠的细胞外基质进行类器官培养，类器官仍能维持稳定的生长和扩增，但培养成本极大降低，从而引起了众多科学家对类器官培养体系中其他成分替代品的探索[50]。

综上所述，类器官技术的快速发展，使得多癌种类器官生物库相继建立。通过CRISPR技术的基因编辑，也为类器官在癌症研究中的多方面应用提供了可能。基于类器官可以保留对应组织的外显子和转录组学特征，通过多点取样来研究类器官的肿瘤异质性、药敏异质性、药敏分子分型等已经成为近年来的研究趋势。鉴于肿瘤类器官在药敏筛选中的关键作用，相信其将来会在个性化医疗中发挥决定性作用，为患者提供更好的精准医学方案。

张宁，教授，国家“万人计划”入选者，国家杰出青年科学基金获得者，科技部中青年科技创新领军人才，人事部百千万人才，天津市杰出人才，教育部新世纪优秀人才，天津市特聘教授，天津市“千人计划”入选者，天津市十佳杰出留学回国人员，天津青年科技奖获得者，美国李氏基金会杰出成就奖获得者。现担任北京大学第一医院肿瘤转化与研究中心常务副主任，天津医科大学肿瘤医院研究所学术带头人，中国抗癌协会常务理事、副秘书长，中国抗癌协会期刊出版专业委员会主任委员，纳米肿瘤学专业委员会前任主任委员，Cancer Biology & Medicine常务副主编。近五年在Cancer Cell、Gastroenterology、Nature Communications、Genome Research等国际期刊中发表SCI文章48篇，总影响因子为436.827，在癌症研究领域产生了重要影响。 长期从事生物医学、细胞生物学及肝癌异质性研究，围绕癌转移这一关键临床难题，从机制研究、生物标志物鉴定、药物筛选、分子遗传学、纳米技术等多个侧面入手展开转化应用研究，取得了一系列科研成果。在肝癌异质性研究领域，开展大规模、具有病种代表性的肝癌患者的单细胞组学研究，揭示肝癌细胞异质性规律和肝癌免疫微环境抑制性规律，结合临床信息，揭示新的治疗靶点和免疫微环境种类