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作者：

李秀山

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摘要：

紫外辐射敏感蛋白RAD23,是一种核苷酸切除修复因子,参与了DNA损伤核酸修复,细胞应激反应和生长发育等。真核生物体内的RAD23蛋白参与DNA损伤修复功能已有广泛研究,但RAD23蛋白在植物体内对细胞光损伤修复作用尚不清楚,因此,本文通过对Rad23家族基因生物信息学的分析以及大量突变体植株系统的研究,得到了如下研究结果: (1)分析了Rad23-4基因的时空表达特性及其蛋白定位,并系统研究了Rad23-4基因在紫外胁迫应答过程中的作用。结果显示:紫外胁迫处理后,rad23-4与野生型相比其花粉颗粒活性明显降低,种子败育率增加以及体内花青素含量明显降低。对一系列与NER修复相关基因进行分析表明,突变体Rad23-4T-DNA插入突变体内rad4基因mRNA表达量急剧降低,突变体内rad1、rad7、rad16基因表达和野生型表达中变化不大。其体内rad-4基因表达量和花青素含量降低,表明Rad23-4基因在植物的紫外胁迫应答中起重要作用。 (2)实验成功构建了pCold-RAD23重组载体,pCold-RAD23重组载体经IPTG诱导后获得了表达,利用纯化后的重组蛋白制备了多克隆抗体。通过ELISA和WB方法检测制备的抗体具有较高的效价和特异性。同时,WB实验检测该抗体能识别植物体内的RAD23蛋白,免疫组化实验发现RAD23蛋白在花粉粒中表达较多。为进一步研究RAD23重组蛋白在体外是否具有紫外损伤修复功能,检测了重组蛋白处理后细胞的表型,实验发现构建的重组蛋白pCold-RAD23对紫外线损伤Hela细胞具有保护作用。 (3)通过在ABA、NaCl、蔗糖和甘露醇等胁迫条件处理下,分析了拟南芥4种Rad23突变体植株的表型,实验发现Rad23-1、Rad23-3T-DNA插入突变体对ABA、NaCl、蔗糖和甘露醇都不敏感,而Rad23-2、Rad23-4T-DNA插入突变体对ABA和NaCl敏感,但对蔗糖和甘露醇不敏感。用ABA和NaCl处理后,与野生型相比,Rad23-2、Rad23-4T-DNA插入突变体萌发率明显降低,根伸长也受到抑制。同时,实验分析了Rad23-2、Rad23-4突变体和野生型体内胁迫诱导相关基因表达情况,结果表明:与野生型相比,Rad23-2、Rad23-4T-DNA突变体内胁迫应答基因RA29A/B,DREB1A/2A的表达降低,将35S∷Rad23-2,35S∷Rad23-4过表达到缺失突变体中,表型均得到回复,证明Rad23-2,Rad23-4能正调控相关胁迫应答基因。 (4)运用GUS染色方法检测了Rad23-2基因的GUS活性,结果发现Rad23-2基因在幼苗以及成年植株的花粉粒中GUS活性较强,而花瓣、萼片和雌蕊等组织中的GUS活性较弱;rad23-2突变体与野生型相比,rad23-2突变体的花粉粒发育不良,萌发率下降,种子败育率增加,将35S∷Rad23-2过表达到rad23-2缺失突变体中,表型得到回复。对一系列与花粉和绒毡层发育相关的基因检测分析发现,EMS1和TPD1在突变体rad23-2和野生型表达中变化不大,而MYB33/MYB65和AMS在rad23-2缺失突变体中的表达量明显低于野生型,而将35S∷Rad23-2过表达到rad23-2缺失突变体中,能回复MYB33/MYB65和AMS基因的表达,证明Rad23-2基因通过正调控MYB33/MYB65和AMS基因来影响花粉粒发育。

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关键词：

拟南芥 Rad23家族基因 NER修复 胁迫应答基因