1.本发明属于水环境中微量有机物分析与检测技术领域，尤其涉及一种水环境中微量雌激素类物质的检测方法。

背景技术：

2.内分泌干扰物（edcs）是一类干扰生物体内激素的合成、排泄以及活性的外源性物质。edcs作为天然和人工合成的持久性化学物质包括农药、重金属和激素等。在激素中，雌激素由于其种类繁多、反应活性高、存在频率高以及在水体环境中存在一定的浓度而受到广泛的关注。根据其来源，雌激素可分为雌酚酮、17β‑雌二醇、雌三醇等天然雌激素和炔雌醇、双烯雌酚等合成雌激素。此外，一些使用于塑料工厂的化学添加剂，例如双酚a，可以充当雌激素模拟物。3.雌激素类物质被广泛地应用于人类和动物的治疗和作为畜禽的生长促进剂，最终又以尿液和粪便的形式被排放到自然水体中。传统的市政废水处理工艺不足以去除雌激素类物质，以致于在地表水中检测到ng/l‑μg/l浓度级别的雌激素。长期接触即使是ng / l浓度级别的雌激素类物，会引起生物体生育机能下降，从而对周边生态环境系统以及人类健康造成重大威胁。对雌激素类物质的有效控制，一种具有高灵敏度的检测水环境中雌激素类物质分析方法的开发是前提。4.目前，固相萃取‑液相色谱串联质谱技术(spe‑lc‑ms/ms)具有快速检测、较高的灵敏度和分离效率等优势，已被广泛用于测定环境样品中的痕量污染物。spe具有快速方便的处理过程，能从各种样品中高效萃取多种有机化合物，因而，常作为提高检测灵敏度的重要前处理方法。5.目前的分析方法中，大多数是在去离子水或具有简单或单一基质的环境样品下对雌激素类物质进行检测。然而，复杂的环境基质往往会对样品浓度测试结果产生较大偏差，进而导致检测方法的适用性变差。因此，亟需提供一种能够在多种水环境中准确并灵敏地检测雌激素类物质的方法。

技术实现要素：

6.本发明目的旨在提供一种水环境中微量雌激素类物质的检测方法，采用固相萃取结合液相色谱串联质谱法，通过优化固相萃取条件，使所述检测方法能够快速准确高效地对多种水环境中的雌激素类物质进行检测。同时基于多种环境水质，使得此方法可获得准确而可靠的结果。7.为了实现上述目的，本发明采取了以下技术方案。8.本发明提供了一种水环境中微量雌激素类物质的检测方法，具体按如下步骤进行：（1）水样的预处理水样经玻璃纤维膜过滤去除不溶性悬浮颗粒，加入edta‑2na溶解，加入雌激素内标混合储备液，并调节ph至9；ꢀ（2）固相萃取富集目标雌激素依次用乙酸乙酯、甲醇和超纯水对固相萃取柱进行活化；将步骤（1）中处理过的水样经已活化的固相萃取柱富集；再在负压下用淋洗液淋洗固相萃取柱；并在常压下用一定体积的洗脱溶剂洗脱目标物，收集洗脱液并进行氮吹，后定容；过滤后置于进样瓶中，待测； （3）采用高效液相色谱串联质谱法对水环境中雌激素类物质的含量检测采用内标法，在高效液相色谱串联质谱仪上，定量检测经步骤（2）处理得到的进样瓶内的待测样品中从水环境中富集到的雌激素类物质的含量；所述的雌激素物质包括雌酚酮、17β雌二醇、雌三醇、炔雌醇、双烯雌酚和双酚a。9.进一步地，步骤（1）中，固相萃取前加入100 μl的1 mg/l 17β雌二醇‑d3、炔雌醇‑d4、己烯雌酚‑d8和双酚a‑d8这四种内标物质混合储备液。10.进一步地，步骤（1）中，以孔径为0 .47mm的玻璃纤维滤膜进行过滤；加入edta‑2na使水样中的浓度达到0.0014 mol/l以屏蔽ca2+和mg2+；所述调节ph至9为采用1 mol/l naoh调节。11.进一步地，上述步骤（2）中，浓缩富集样品所用的固相萃取柱是cnw®ꢀhc‑c18小柱，其吸附剂为烷基键合二氧化硅，更适合于萃取极性相对较弱的化合物。12.进一步地，上述步骤（2）中，水样以2 ml/min 的流速载入到活化后的萃取柱上进行富集，富集结束后继续抽真空30min。13.进一步地，上述步骤（2）中，淋洗固相萃取柱依次用甲醇水溶液和ph 9.0 超纯水以洗去干扰杂质，流速为1ml/min，淋洗结束后抽真空干燥10 min。14.更进一步地，所述淋洗液中，所述甲醇水溶液的浓度为5％，是为了从复杂的水质基质中有效去除干扰物质，并将目标分析物保留在吸附剂上。15.更进一步地，上述步骤（2）中，使用纯甲醇作为洗脱溶剂洗脱目标雌激素类物质，为了能有更高的萃取效率。16.更进一步地，上述步骤（2）中，将收集的洗脱液置于35 ℃的恒温水浴中，以15 l/min 温和的氮气流下吹至近干；用纯甲醇定容后，超声溶解10 min，再经0.22 μm 聚四氟乙烯滤头过滤。17.进一步地，上述步骤（3）中，选用日本岛津公司的lcms‑8050高效液相色谱串联质谱仪；所使用的色谱柱为c18液相色谱柱2 .1mm×100mm×1 .9μm。18.进一步地，上述步骤（3）中，液相色谱条件如下：色谱柱柱温40℃；进样量5μl；流动性流速0.4 ml/min；流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为0.075‰氨水溶液，所述流动相b为体积比1:1的甲醇和乙腈的混合溶液；梯度洗脱程序为：0‑1.5min，35％b；1.5‑6.5min，35‑75％b；6.5‑6.6min，75‑95%b；6.6‑8.0min，95％b；最后，还原初始流动相状态并保持2min。19.进一步地，上述步骤（3）中，质谱检测条件为：电喷雾电离负离子模式（esi‑）；扫描模式为多反应监测（mrm）；碰撞气体为氩气；雾化气体为氮气流量为3 l/min；干燥气和加热气均为氮气流量为10 l/min；dl温度为250℃；加热模块温度为400℃。20.本发明中，所述多种水质包括去离子水，自来水，地表水，以及畜禽养殖废水处理工艺的进水和出水。21.本发明的有益效果在于：本发明提供了一种采用固相萃取结合液相色谱串联质谱法能够快速准确高效地对多种水环境中的雌激素类物质进行检测。同时基于多种环境水质，使得可获得准确而可靠的结果。22.本发明的方法最终选择c18作为固相萃取柱，纯甲醇作为洗脱剂以及将溶液ph控制在9.0，以获得最佳萃取效率；而且试剂简单消耗少，降低了检测成本。23.本发明的方法通过通过校准曲线的线性，检测限（lod）和定量限（loq）对分析方法进行了验证；线性关系好，检测限低，相对标准偏差小，提高了检测分析的精密度。24.本发明的方法优选了内标物质(指示回收率替代物)加在固相萃取过程前，能够很好地表示前处理过程中目标物质的损失；选用17β雌二醇‑d3作为雌酚酮、17β雌二醇和雌三醇的内标物，选用炔雌醇‑d4作为炔雌醇的内标物，选用己烯雌酚‑d8作为双烯雌酚的内标物，选用双酚a‑d8作为双酚a的内标物，由于内标物选用恰当，使得最终检测结果更加真实可靠。25.本发明的方法通过在4种具有不同特征的实际水环境样本中以良好线性关系的校准曲线提供适当的量化策略，以便为每种基质获得准确而可靠的结果，完全能适用于多种水环境中的雌激素类物质的检测。附图说明26.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明中雌激素类物质的色谱图。图2为本发明中各雌激素类物质检测离子总结。图3为本发明中各种水质中雌激素类物质的线性、lod和loq。具体实施方式27.为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。28.实施例：本实施例采用内标法，检验按本发明的固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测去离子水，自来水，地表水，以及畜禽养殖废水处理工艺的进水和出水中雌激素类物质的校准曲线线性，lod和loq。向环境样品中添加雌激素类物质混合标准溶液（该混合标准溶液为6种雌激素类物质的混合标准储备溶液，其中，浓度为1000 mg / l）使富集后的校准曲线基于6个浓度水平分别为4 μg/l、10 μg/l、20 μg/l、50 μg/l、100 μg/l、200 μg/l（富集倍数分别是去离子水和自来水为250倍，地表水为500倍，畜禽养殖废水处理工艺的进水和出水为50倍）。29.本发明是采用固相萃取结合液相色谱串联质谱法检测多种水环境中的雌激素类物质的方法，具体按如下步骤进行：（1）水样的预处理设立6个加标浓度，1个空白组（空白组不添加任何雌激素类物质）。去离子水和自来水每组取250 ml水样，地表水每组取500 ml水样，畜禽养殖废水处理工艺的进水和出水每组取50 ml水样并于洁净烧杯中稀释至500 ml。6组加标浓度样品，按上述添加量分别加入雌激素类物质混合标准溶液，即使富集后的雌激素类物质浓度分别为4 μg/l、10 μg/l、20 μg/l、50 μg/l、100 μg/l、200 μg/l。加标后样品充分混合均匀，经玻璃纤维膜过滤去除不溶性悬浮颗粒。30.固相萃取前加入100 μl的1 mg/l 17β雌二醇‑d3、炔雌醇‑d4、己烯雌酚‑d8和双酚a‑d8这四种内标物质混合储备液。31.加入edta‑2na使水样中的浓度达到0.0014 mol/l以屏蔽ca2+和mg2+；所述调节ph至9为采用1 mol/l naoh调节。32.（2）固相萃取富集目标雌激素使用cnw®ꢀhc‑c18小柱作为固相萃取柱，其吸附剂为烷基键合二氧化硅，更适合于萃取极性相对较弱的化合物。固相萃取过程如下：依次用5 ml乙酸乙酯、甲醇和超纯水对固相萃取柱进行活化。水样以2 ml/min 的流速载入到活化后的萃取柱上进行富集，富集结束后继续抽真空30 min。富集结束后，依次用5 ml体积浓度为5%甲醇水溶液和ph 9.0 超纯水以流速为1 ml/min洗去干扰杂质，淋洗结束后抽真空干燥10 min。最后在常压下用10 ml纯甲醇洗脱目标雌激素类物质，将洗脱液收集并置于35 ℃的恒温水浴中，用15 l/min的氮气流吹至近干。用纯甲醇定容至1 ml后，超声溶解10 min，再经0.22 μm 聚四氟乙烯滤头过滤，置于进样瓶中，待测。33.本发明中通过实验对比了c18和hlb（亲水‑亲脂平衡聚合物）两种固相萃取柱，发现c18柱对于弱极性的雌激素类物质具有更好的保留效果。本发明还通过实验对比了分别用乙酸乙酯（etac）、甲醇（meoh）、meoh: etac=1:1、meoh: etac=3:1以及 meoh: 水=1:1这五种洗脱液洗脱目标雌激素类物质，发现纯甲醇作为洗脱剂具有更高的萃取效率。本发明还通过实验对比了溶液ph为3、5、7、9、11这五种情况，发现ph为9情况下具有较好的萃取效率。34.（3）采用高效液相色谱串联质谱法对水环境中雌激素类物质的含量检测采用内标法，在高效液相色谱串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的从去离子水、自来水，地表水，以及畜禽养殖废水处理工艺的进水和出水中富集到的雌激素类物质的含量。35.选用日本岛津公司的lcms‑8050高效液相色谱串联质谱仪；所使用的色谱柱为c18液相色谱柱2 .1mm×100mm×1 .9μm。36.液相色谱条件如下：色谱柱柱温40℃；进样量5μl；流动性流速0.4 ml/min；流动相包括流动相a和流动相b，所述流动相a为0.075‰氨水溶液，所述流动相b为体积比1:1的甲醇和乙腈的混合溶液；梯度洗脱程序为：0‑1.5min，35％b；1.5‑6.5min，35‑75％b；6.5‑6.6min，75‑95%b；6.6‑8.0min，95％b；最后，还原初始流动相状态并保持2min。37.质谱检测条件为：电喷雾电离负离子模式（esi‑）；扫描模式为多反应监测（mrm）；碰撞气体为氩气；雾化气体为氮气流量为3 l/min；干燥气和加热气均为氮气流量为10 l/min；dl温度为250℃；加热模块温度为400℃。38.图1为利用本发明的检测方法得到的雌激素类物质色谱图。39.本实施例中，各雌激素类物质检测离子总结见图2所示。40.本实施例中，最终测得的各种水质中雌激素类物质的线性、lod和loq，如图3所示。[0041] 根据图3中的实验结果表明：4种实际环境水质样品的相关系数r2高于0.994，说明其校准曲线同样具有极好的线性。且具有较低的检测限（地表水的lod为6.4‑76.6 ng / l，废水样品的lod为45‑503 ng / l），能够达到检测多种水环境中雌激素类物质的要求。[0042]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。