RNA和DNA的分子结构示意图

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新冠病毒的遗传物质为RNA，由此归属为RNA病毒。RNA的单链结构更容易发生变异（也可以理解为进化），此次的新冠病毒其实也是经历了大量排列组合的“历练”以及“层层筛选”，最终“机缘巧合”地进化出兼具高度传染性和致病性的特点。

（二）核酸检测是什么

核酸检测顾名思义就是针对核酸开展检测。

核酸检测有何独特的优势呢？为何能作为新冠病毒确诊的“金标准”呢？

其实每一种检测方法都有其擅长的应用场景。以病毒检测为例，通常的免疫学检测方法（胶体金、ELISA、化学发光等）的检测对象是病毒的抗原或抗体，相当于“侧面描绘”。由于从感染到可检测存在一个时间窗口期，因此免疫学检测方法一般不合适作为早期诊断。

补充知识：

从机体对新冠病毒的体液免疫应答来看，新冠病毒的S蛋白、N蛋白等会刺激免疫系统引起抗体应答，随后出现IgM抗体、IgA抗体、IgG抗体。遵从急性感染的一般过程，当IgG抗体出现后，IgM持续降低直至消失，IgG浓度会持续增加并较长时间存于血清中。但是IgM和IgG需要感染一段时间后才会产生。

而核酸检测的检测对象是病毒的遗传物质，则是“正面追击”。理论上只要有一个病毒就可以检测到，因此核酸检测很合适作为早期诊断。而且核酸检测可以针对病毒遗传物质中特定的特异性区域，因此特异性很高，一旦检测到，则可以判断为阳性。

及早地确诊疑似患者对抗击新冠病毒疫情至关重要。而核酸检测正是兼具合适早期诊断以及高度特异性的优点，从而成为了此次确诊感染的“金标准”。

核酸检测主要包括核酸电泳、核酸杂交、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）、基因芯片、基因测序等。其中，PCR技术由于操作方便、可以快捷地获得定性或定量检测结果，是科研和临床中广为使用的一种核酸检测方法。

二

步入正题：PCR原理

PCR技术由Kary Mullis于1988年首创，技术上实现了在体外模拟发生于细胞内的DNA快速扩增特定基因或DNA序列复制的过程。随着技术的发展，PCR已经衍生出很多不同的细分技术，例如quantitative PCR、multiplex-PCR，variable number of tandem repeats (VNTR) PCR，asymmetric PCR，nested PCR，touchdown PCR，digital PCR等等。

这么多技术，其实都绕不开最基本的PCR原理。

（一）PCR的基本过程

PCR一般会经历多轮温度循环，其中每一轮温度循环包括变性（denaturation）、退火（anealing）和延伸（elongation）三步。

变性是在高温（95℃左右）条件下，DNA模板双链打开的过程，使之能够与引物结合，为下面的反应做准备。退火是在冷却后（一般在68℃左右），变性后的DNA单链与引物通过碱基互补配对（A-T、C-G），再次形成局部双链。延伸是在DNA单链模板与引物特异性结合（俗称“接头”）之后，于72℃左右的温度下TaqDNA聚合酶发生作用，以脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate, dNTP，主要包括dATP、dUTP、dTTP、dCTP、dGTP）为原料，以靶向序列为模板，碱基互补配对为原则，再次合成完整的双链DNA的过程。经过延伸复制之后，有一条链是新合成的，另一条则是原有模板，于是此种复制方式称为半保留复制（semiconservative replication）。

通过多轮温度循环，初始少量的DNA模板以“一变二、二变四”这样的指数扩增方式，最终得到大量复制的DNA模板产物。

PCR原理示意图

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PCR原理动态示意图

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（二）PCR反应的组成成分

PCR反应的组成成分主要包括检测模板（DNA template）、引物（primer）、Taq酶、dNTP、缓冲液（buffer）。

PCR的组成成分

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1、模板

模板一般为DNA，有时也称底物。在检测过程中，首先使用提取/纯化试剂盒将血液等样品中的全部核酸给提取出来，而待检的DNA模板则“混迹”于其中。

2、引物

引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3’-端开始合成新的核酸链。

3、dNTP

dNTP主要包括dATP、dUTP、dTTP、dCTP、dGTP，dNTP是PCR扩增所需的基础原料。

4、酶

DNA聚合酶是PCR反应中的关键成分，其主要在延伸步骤中发挥作用。由于PCR中的延伸步骤一般在72℃左右进行，因此反应体系中的DNA聚合酶需在该高温下仍保持高效的活性。筛选合适的酶对提升反应效率、节约反应时间是最为直接有效的手段。最经常使用的便是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus 中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶，简称Taq酶。

5、缓冲液

缓冲液为反应提供了均质稳定的反应环境，成分较为复杂。主要包括缓冲体系、Mg2+、辅助成分（维持酶的活性）等。

三

渐入佳境：逆转录PCR与荧光PCR

PCR相当于一个“放大器”，让我们有能力检测到微量或痕量DNA的踪迹。但实际检测中，并非所有的待检样本为双链DNA，例如新冠病毒的遗传物质便是单链RNA。

此时对于这类单链RNA将如何检测呢？在“看到”模板是否存在的基础上，是否可以“测量”模板多少呢？

这便衍生出逆转录PCR（reverse tranion-PCR, RT-PCR）和实时荧光定量PCR（realtime-PCR，常简称为荧光PCR、缩写为qPCR）技术。

（一）逆转录PCR

RNA是个单链，为了使用PCR手段对其进行检测，关键在于将RNA变成双链。

于是，RT-PCR则是先将单链RNA逆转录为双链cDNA（complementary DNA），然后再以cDNA为模板，历经PCR过程。

（二）荧光PCR

理论上，经典PCR中DNA模板的扩增遵循指数增长规律，但受限于实际反应条件，经过多轮循环后，PCR反应将进入“平台期”而产生偏离。对经典PCR终点的DNA模板进行检测，本质上仍是一种定性或半定量检测，可以用于判断待测核酸模板是否存在、以及相对含量多少 。

而realtime-PCR则实现了从定性检测向定量检测的飞跃。产生飞跃的关键因素，是在经典PCR中加入了荧光物质，通过实时检测荧光强度实现实时监测PCR过程（在一段区间范围内，荧光强度与模板数量呈正向线性关系）。根据荧光物质的特异性不同，可分为非特异性的荧光染料以及特异性的荧光探针两大类。

随着PCR的进行，可以绘制得出荧光信号强度随循环次数（测试时间）的一条曲线。

荧光信号强度-循环次数的曲线示例图

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对于所检测得到的弯曲曲线，如何对曲线进行定量分析呢？

关键在于定义一个荧光阈值（threshold）。所定义的threshold对应的循环阈值（ C t）与初始模板的数量多少息息相关，简单来说， C t与初始模板数量呈现负相关关系。

有兴趣的可以看以下推导过程：

定义n为循环次数，X0为初始模板数量，Xn为第n次循环后的模板数量，E为扩增效率。对于一个PCR过程，则满足

Xn= X0(1+E)n

其中，Xn与荧光信号强度满足正相关关系。

对于设定的threshold为一个常数K，则满足

XCt= X0(1+E)Ct= K

可推导出

lgX0= -Ctlg(1+E)+lgK

或

Ct= -lgX0/lg(1+E) + lgK/lg(1+E)

其中，对于一个特定的PCR过程，E和K均为常数，由此， X0与Ct为负相关关系。也即Ct越低，代表初始模板数量越高。

举一个小例子，让大家相对直观地感受一下初始模板数X0与Ct两者间的负相关关系。

某个试剂盒的扩增效率为100%，标准样品中含有100 个模板，对于设定的threshold，标准样品对应的 Ct,std为25.000 ；假设有两个未知样品（待测模板与标准样品的模板相同），样品A测试结果为 Ct,A为21.678 ，样品B测试结果 Ct,B为28.322 。那样品A和样品B分别对应多少个模板数呢？

计算结果如下：

K = XCt= 100×(1+1)25= 100×225

或

lgK ≈ 9.526

则对于样品A，

lgX0,A= -Ctlg(1+E) + lgK = -21.678×lg2 + 9.526

或

X0,A= 10-21.678×lg2 + 9.526≈ 1000

则对于样品B，可同理计算得到

X0,B= 10-28.322×lg2 + 9.526≈ 10

由此，可以相对直观地认识到初始模板数X0与Ct两者间的负相关关系。

（三）逆转录PCR联手荧光PCR

通过联合逆转录PCR和荧光PCR技术，则衍生出实时荧光逆转录聚合酶链式反应（realtime reverse tranion PCR, qRT-PCR）技术，由此可以对单链RNA进行定量检测。

为了检测新冠病毒的RNA，最合适的便是qRT-PCR了，由此也作为推荐检测方法写入了《新冠诊疗方案第七版》 。

四

实战演练：PCR用于病毒核酸检测

（一）判定标准

不同的qRT-PCR试剂盒的技术参数不同，具体的判定标准可能有微小差异，差异主要在于 C t的大小。

举个例子，假设某个或批的qRT-PCR试剂盒，循环数为40，选取参考 C t为37。

则当 C t为40或不存在时，判定为阴性。

当 C t