抑制性消减杂交技术自1996年报道以来, 该技术已被多名研究者采用, 并与其他分子生物学技术相结合, 克隆了多种新基因.

在慢性肝炎、肝纤维化和肝细胞癌的发生发展中基因调控的研究应用. 乙型肝炎、丙型肝炎慢性化机制目前尚不清楚, HBV、HCV进入肝细胞后, 病毒基因组表达的反式激活蛋白对肝细胞基因组具有反式调节作用[11,12], 从而影响肝细胞生长调节, 可能是HBV、HCV感染慢性化及发生恶性转化的重要分子生物学机制之一. 刘妍et al[13]在研究乙型肝炎X蛋白(HBxAg)反式激活作用时, 应用SSH方法构建了HBxAg反式激活相关基因差异表达的cDNA消减文库, 随机挑选65个克隆测序分析, 结果主要包括2种类型, 第一种是已知基因的序列, 与GenBank中数据高度同源(96-100%), 其中包括一些已知的看家基因序列和一些与细胞生长调节密切相关的基因序列, 如真核翻译启动因子、核糖体蛋白编码基因, 与细胞的转录、翻译功能密切相关; 乙肝病毒X基因, 与转染的HBx基因的表达有关; 胶质母细胞瘤放大的分泌蛋白, 肿瘤抑制因子ST13, Bcl-2结合蛋白Nip3, 可能与肝细胞凋亡及恶性转化密切相关; S100钙结合蛋白, 鸟嘌呤核苷酸蛋白(G-蛋白)与细胞周期生长调节及信号转导途径密切相关. 第二种是未知基因序列, 共获得15个差异表达的未知序列, 其功能有待进一步研究. 同时应用抑制性消减杂交技术构建HCV核心蛋白反式激活基因差异表达的cDNA消减文库[14], 经测序分析后, 所得克隆包括6个未知序列, 56已知的看家基因及与细胞生长调节密切相关的基因如WEE1. 这些研究结果对阐明乙、丙型肝炎慢性化及HBV、HCV致肝细胞癌发生之间的关系具有重要的理论意义. Nagayama et al[15]在研究自身免疫性肝炎(AIH)发病机制的过程中, 利用SSH技术, 发现AIH肝细胞干扰素诱导蛋白10 (interferon inducible protein 10, IP10) mRNA表达较正常肝细胞明显增强, 同时运用免疫组化方法证明IP-10在AIH肝细胞中过量表达, 且运用逆转录PCR分析63例不同类型肝炎组织标本, AIH中IP-10表达明显高于其他类型肝炎, 因此作者认为IP-10表达升高是AIH的标志, IP-10在AIH的发病机制中起重要作用. 在肝纤维化研究方面, Cassiman et al[16]利用SSH技术比较正常鼠HSC与D-半乳糖胺诱发肝炎鼠的HSC mRNA表达差异, 结果发现αB-晶体蛋白(alpha B-crystallin, ABCRYS)表达上调. 实验证实, 在人和鼠HSC体外细胞培养中加入gal内毒素后也发现ABCRYS mRNA表达升高, 作者认为, ABCRYS可能是HSC激活后的早期标志, 有利于HSC存活, 对其研究将有利于了解肝纤维化发展的机制.

抑制性消减杂交技术在肿瘤相关基因克隆化中也有重要的应用前景. 在肿瘤相关基因的研究中, Miyasaka et al[17]利用SSH技术研究丙型肝炎相关肝癌及癌旁组织基因表达不同, 发现了一些过度表达的基因, 7个已知基因包括灶性粘连激酶(focal adhesion kinase, FAK)、结肠癌缺失基因(deleted in colon cancer)、鸟嘌呤结合阻止蛋白α(guanine binding inhibitory protein α)、M130、胃蛋白酶原C(pepsinogen C)、谷氨酰胺合成酶(glutamine sythetase)、鸟氨酸转氨酶(omithine aminotransferase)以及2个未知基因(HCC-1和HCC-2). 其中灶性粘连激酶磷酸化激活后能阻止凋亡, 胃蛋白酶原C的表达在前列腺癌中受雄激素水平的调节[18], 而HCC是以男性为主的疾病[19], 胃蛋白酶原C和灶性粘连激酶在HCC发生中的作用尚不明确, 但HCC中二者过度表达可能为研究HCC发病机制提供新的方向. Piter et al[20]用SSH获得肾细胞癌组织与非转化肾组织差异表达基因, 共获得9个在肾细胞癌中差异表达的cDNA, 序列分析表明7个与已知基因同源, 2个为新基因, 克隆的7个已知基因中的5个与肿瘤的恶性表型有关. Wang et al[21]用SSH技术在食管癌中鉴定出一个命名为EC45基因, 其在70 %食管癌中过度表达, 且与核糖体蛋白L15的开放读码框架有100%同源性. 说明SSH对肿瘤组织是一种高灵敏度的有效的鉴别差异表达序列的方法.

在器官发育方面, Diachenko et al[7]用SSH技术建立了一个睾丸特异性cDNA文库, 用消减的cDNA混合物作为一个杂交探针来鉴定人Y染色体基因库的同源性, 进一步证实了这个人类DNA是以睾丸特异性方式而表达. 在免疫学方面, Roh et al[22]在研究破骨细胞分化过程中基因的调控作用时, 将SSH技术与cDNA微陈列技术相结合, 建立了破骨细胞与巨噬细胞、破骨细胞与树突状细胞mRNA差异性表达文库, 以及TRANCE诱导造血干细胞分化为破骨细胞过程中mRNA差异性表达文库, 提供了研究破骨细胞分化基因调节及骨肿瘤相关基因的新方法. Li et al[23]用SSH方法检测了人类特异性过敏源性Th2细胞中差异表达基因, 分析并鉴定出72个序列, 这种差异性Th2基因文库可能阐明Th2细胞功能和变态反应性疾病的遗传学基础. Wang et al[24]在寻找脑局部缺血耐受的相关基因中, 用SSH方法筛选出差异表达基因基质金属蛋白酶-1抑制剂编码基因, 提示其在局部缺血耐受中发挥潜在作用.

高等真核生物的所有生命现象, 例如细胞生长、器官形成、恶性转化都是基因选择性表达的结果, 要弄清这些生命现象的分子调节机制, 就要对选择性表达的基因进行分离、克隆、序列分析, 然后研究其氨基酸组成, 表达产物结构、功能等. 抑制性消减杂交技术为寻找表达基因和研究已知基因的新生物学功能提供了一个有利工具. 并且由于抑制性消减杂交技术可用于比较不同细胞、不同组织的基因表达差异, 因此必将在生物发育、细胞调控、肿瘤、衰老及组织损伤的研究中得到越来越广泛的应用.