（6）胶原酶II和Dispase II组合酶解。

所有溶液均添加DNAse I（100 U，Sigma-aldrich DN25）。使用前，将木瓜蛋白酶在37°C和5％CO2下活化30分钟。为停止所有酶的消化，将样品用冷HBSS稀释并置于冰上，然后使用5 ml移液器将溶液进一步打匀10次，并通过70μm细胞过滤器过滤，将得到的单细胞悬液在RT下以300g离心10分钟。

接着，使用Percoll™（GE Healthcare 17-0891-01）梯度离心去除髓磷脂并富集活胶质细胞的匀浆。制备等渗Percoll（SIP）的储存液（9份Percoll，1份10x HBSS）。将细胞沉淀重悬于30％（3 ml SIP加到7 ml 1X HBSS重悬的细胞悬液上方）或30–70％（将3ml用1x HBSS稀释的70％SIP溶液放入14ml试管中，然后用10 ml含有细胞悬液的30％SIP覆盖）SIP。对于两种类型的Percoll离心，均需加入1X HBSS进行洗涤，以300 g离心10分钟，然后重悬于10 ml 1X红细胞裂解缓冲液中，最后将细胞沉淀重悬于50μl封闭缓冲液中，该封闭缓冲液由1X PBS、0.5％牛血清白蛋白（BSA）和2 mM EDTA配制而成。

为了确定细胞死活，添加DAPI并孵育10分钟。1μg/ mlDAPI浓度比较适合区分活细胞和死细胞（Gordon et al。，2003）。样本用1 ml封闭缓冲液洗涤，并在300g下离心5分钟。最后，将细胞沉淀重悬于500μlPBS中，并立即上机。

流式设门步骤如下图，值得参考，将星形胶质细胞、活化小胶质细胞、静息小胶质细胞、淋巴细胞均清晰的区分开：

实验结果如下：

1、在没有酶促孵育的情况下， 使用机械解离可以更好地得到星形胶质细胞，而酶通常会损害星形胶质细胞。但是，与酶处理相比，新生小鼠和成年小鼠大脑的非酶消化通常导致总细胞、小胶质细胞和淋巴细胞的得率较低。

2、 组织消化后去除髓磷脂和细胞碎片不仅对于流式细胞仪至关重要，对于其他下游应用（包括基因和蛋白质表达的测量）也至关重要。该研究采用两种密度梯度离心：30％和30–70％，发现使用30％Percoll，总细胞回收率提高了三倍以上。像这样的单一梯度主要旨在有效去除髓磷脂和碎片。与多密度梯度相比，它们的设置时间更少，并且避免了从层间相移液的困难。此外，在30％Percoll中离心的细胞中通常具有较高的活力。

3、关于酶消化，该研究集中于 木瓜蛋白酶、胶原酶II和Dispase II。尽管一些研究使用胰蛋白酶消化大脑（Bronstein等，2013; Saura等，2003; Schildge等，2013），但有证据表明该酶可以激活神经胶质细胞并损害其活力（He等, 2019年；Singh等，2014年）。因此，胰蛋白酶与其他酶（如透明质酸酶或Accutase）均被排除在外。

4、根据研究中的数据， 木瓜蛋白酶与Dispase II结合可以有效地从新生小鼠中提取总神经细胞（每个大脑5.6×10E6），或从成年小鼠大脑中提取静息小胶质细胞（占总细胞的21％）。另外，木瓜蛋白酶通常对新生小鼠细胞的危害要小于其他酶。然而， 木瓜蛋白酶对成年小鼠星形胶质细胞影响特别大。

5、关于 中性蛋白酶Dispase II，当单独使用时，表现温和，其解离值通常接近非酶消化。但是，将Dispase II与木瓜蛋白酶联合使用时，观察到从新生小鼠提取的总细胞数量显著增加，并且从成年小鼠中回收的静息小胶质细胞和淋巴细胞数量得到改善（分别为32％和52％） 。但是，添加Dispase II通常会降低提取的细胞活力。即使如此，仍认为 木瓜蛋白酶与Dispase II组合是从成年小鼠大脑获得静息小胶质细胞的最佳选择。

6、尽管胶原酶II 通常用于从中枢神经系统中分离免疫细胞，但在此实验中，相对于其他方法，总神经细胞的回收率较差。

这样，整篇文章下来，既完整的教了大家获取小鼠大脑免疫细胞的最佳方法，而且给出了检测小鼠大脑星形胶质细胞、活化小胶质细胞、静息小胶质细胞、淋巴细胞的方案和设门步骤。非常值得大家参考。

参考文献： Calvo, Belén et al. “Dissociation of neonatal and adult mice brain for simultaneous analysis of microglia, astrocytes and infiltrating lymphocytes by flow cytometry.” IBRO reports vol. 8 36-47. 13 Jan. 2020, doi:10.1016/j.ibror.2019.12.004

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