细胞活性氧检测(ROS) |
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为什么要测ROS? ROS(Reactive Oxygen Species):活性氧 ROS的主要来源是细胞的线粒体呼吸链,线粒体受外界刺激后,细胞ROS水平会升高。过量ROS反过来会对线粒体造成损伤,可能引发线粒体自噬。 ROS与线粒体自噬可见光谱市面上常见的两种荧光探针ROS检测试剂盒: 探针检测ROS的原理——可自行搜索试剂盒说明书,并下载阅读(bing搜ROS assay kit)。 两种探针如果我的细胞系会表达GFP绿色荧光蛋白,应该选用哪种探针检测ROS?为什么呢? ROS 试剂盒说明书实验操作流程:(贴壁细胞为例) 显微镜拍照定性检测ROS:消化细胞并计数,种在24孔板中,确保每孔中细胞数量相等,3个复孔。 细胞密度约80%时,实验组加药培养6h,对照组DMSO处理。 配置探针孵育工作液:避光操作,用培养基稀释探针(1:1000),终浓度10μM(或5μM)。 吸掉旧培养基,PBS洗细胞一次。 避光操作,每孔加入500μl探针工作液,37℃培养箱孵育10-20min(时间过长会导致背景信号高)。 弃掉探针孵育工作液,PBS温和地洗2-3次,然后各孔加入400μl培养基。 利用荧光显微镜200倍观察细胞内红色荧光,调整分辨率、亮度、锐度等到合适的参数,最后每孔随机拍照3张,保存图片。分析结果。 ROS相对定量实验(96孔不透明板) 消化细胞并计数,每孔种10000个细胞,每个处理3-5个复孔。 细胞密度约80%时,实验组加药培养6h,对照组DMSO处理。 配置探针孵育工作液:避光操作,用培养基稀释探针,终浓度10μM。 吸掉旧培养基,PBS洗细胞一次。 避光操作,每孔加入100μl探针工作液,37℃培养箱孵育20min。 弃掉探针孵育工作液,PBS温和地洗1次,然后各孔加入100μl培养基。 在荧光酶标仪上检测荧光强度,保存数据。 之后需要检测CCK-8的操作步骤(检测细胞数量) 配置CCK-8检测工作液,每孔100μl工作液,额外加3个空白孔blank,孵育1h后去检测OD450的值。 荧光强度与总细胞数的比值就是相对ROS水平。 计算方法:ROS的检测值/对应孔CCK-8的检测值。 分析各组ROS水平的差异。
实验要点: 细胞初始数量要相等,ROS工作液需要避光,先用PBS洗干净探针再去检测荧光强度。 具体的探针浓度以及孵育时间,需要自行摸索。 (浓度太高或者时间太长,会导致背景信号高) |
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