B: Venn Diagram (韦恩图)

C: Intensity Scatter Plot (密度分散图)

D: Heatmap (热图)

E: Gene Ontology (GO) analysis

F: GO analysis

如果你认真看完本篇文章，你也能够做出从A到F这些图。

结合之前文章提到的配色方案(关于配色问题，参考以下链接），你会做出很漂亮的A-F，然后开心地放在PPT和论文中！

漆黑的师兄：为什么 PNAS 的图画得往往没有《Nature》、《Science》精致？

A: 火山图 B: 韦恩图 C: 密度散点图

D:热图 E：GO分析

F: GO 分析 BiNGO

RNA-seq的一般流程是这样的

RNA-seq 流程图，图源网络，侵删

mRNA-seq 测序的最原始结果是核苷酸序列，文件大小在4-10GB之间，分析起来相当的繁琐，分析也不是一般的小本本能跑起来的，好在一般来说，我们从测序公司拿到的数据，已经是经过比对和Mapping之后的结果，公司给这个样子的表格：

从公司拿到的excel表格

做好分析，首先要理解每一列每一行代表的意思，那么每一列代表的是什么意思呢？

1) GeneID: 分析出来的基因在基因数据库中的名称。

2) 从第二列到第七列,

分别是WT-raw-counts(-1,-2,-3)和lsd1-counts(-1,-2,-3),可以简单的理解为改Gene在这次测序中读到的总次数。

3) 从第八列到第十三列，分别是WT-CPM(-1,-2,-3)和lsd1-CPM(-1,-2,-3)，可以简单的理解成一个是对照组WT另一个是实验组（Var2）,CPM( counts per million reads)每一百万次读数该基因记到的次数。

4) LogFC （FC: Fold changes）,一般是以2为底数的对数值，代表这个基因在实验组的表达是对照组的多少倍。LogFC≥1（upregulated上调）或≤-1（downregulated下调），即表达量大于等于2或者小于等于2，认为是比较显著的，是很重要的一个参数。

5) LogCPM (CPM, counts per million reads)一般好像用不到这个值，不知道为什么。

6) P_value(基因表达差异的可信度)一般取小于0.05。

7) FDR（False discovering rate）也是指示基因表达差异性是否可靠的值，一般取小于0.05。

8) Gene Type，这是根据数据库对基因的注释（Gene Annotation），一个基因可以从三个方面进行阐释，1）Biological Process; 2) Molecular Function; 3) Cellular Component，即这个基因参与到的生物进程（信号通路），表达的蛋白有什么样的分子功能，表达的蛋白亚细胞定位在哪里，三个方面。

1) GeneID: 分析出来的基因在基因数据库中的名称。

2) 从第二列到第七列,

分别是WT-raw-counts(-1,-2,-3)和lsd1-counts(-1,-2,-3),可以简单的理解为改Gene在这次测序中读到的总次数。

3) 从第八列到第十三列，分别是WT-CPM(-1,-2,-3)和lsd1-CPM(-1,-2,-3)，可以简单的理解成一个是对照组WT另一个是实验组（Var2）,CPM( counts per million reads)每一百万次读数该基因记到的次数。

4) LogFC （FC: Fold changes）,一般是以2为底数的对数值，代表这个基因在实验组的表达是对照组的多少倍。LogFC≥1（upregulated上调）或≤-1（downregulated下调），即表达量大于等于2或者小于等于2，认为是比较显著的，是很重要的一个参数。

5) LogCPM (CPM, counts per million reads)一般好像用不到这个值，不知道为什么。

6) P_value(基因表达差异的可信度)一般取小于0.05。

7) FDR（False discovering rate）也是指示基因表达差异性是否可靠的值，一般取小于0.05。

8) Gene Type，这是根据数据库对基因的注释（Gene Annotation），一个基因可以从三个方面进行阐释，1）Biological Process; 2) Molecular Function; 3) Cellular Component，即这个基因参与到的生物进程（信号通路），表达的蛋白有什么样的分子功能，表达的蛋白亚细胞定位在哪里，三个方面。

当初我拿到这个含有上千甚至上万个基因的Excel表格是，一阵莫名激动，感觉自己马上就要发文章成为大佬受万人膜拜，前途亮的能瞎眼。然而，一股莫名的忧伤涌现，那么多基因，我该怎么办呢？总不能把基因都贴满论文吧？好像没有这样搞的啊！

后来才知道，第一步，先什么都不管，直接把所有基因进行可视化处理，就是上文提到的图A，火山图； 图D, 热图； 根据情况用C。

Volcano Plot

绘制起来比较简单，用到的值就是上文EXCEL表格中的P_value和LogFC。如果要绘制成像图A，灰色的是不显著的基因，红色的是显著上调的基因,就需要在EXCEL里的根据logFC 和P_value,把基因们分为三类（这点，请熟练运用EXCEL中的筛选，和排序功能）

1）P_value大于0.05，不显著的，

2）P_value小于0.05， LogFC大于等于1，显著上调的，

3）P-_value小于0.05， logFC小于等于-1，显著下调的。

1）P_value大于0.05，不显著的，

2）P_value小于0.05， LogFC大于等于1，显著上调的，

3）P-_value小于0.05， logFC小于等于-1，显著下调的。

Excel 中的排序和筛选功能

按P_value 和LogFC 分类后的数据

**选中以上三组数据中的任意一组，比如1）P_value大于0.05，不显著的，

LogFC和P_value两列，X轴设置为LogFC, Y轴设置为P_value

点击 插入图标>选择XY 散点图>

是不是得到一个很奇怪的图，没关系，

a) 可以点击Y轴，设置Y轴格式，选中 “对数刻度”和“逆序刻度值”

b) 点击X轴，设置X轴格式，选择“标签”>“高”，

c) 将纵坐标交叉，自定义设置成最小值

d) 选中图中的点，设置一下数据系列格式，找到“标记”，设置一下标记的大小和颜色（文中设置成灰色）

e) 右击散点图，选择“添加数据”分别把其他两组数据添加进去，Volcano Plot就做好了。

a) 可以点击Y轴，设置Y轴格式，选中 “对数刻度”和“逆序刻度值”

b) 点击X轴，设置X轴格式，选择“标签”>“高”，

c) 将纵坐标交叉，自定义设置成最小值

d) 选中图中的点，设置一下数据系列格式，找到“标记”，设置一下标记的大小和颜色（文中设置成灰色）

e) 右击散点图，选择“添加数据”分别把其他两组数据添加进去，Volcano Plot就做好了。

插入XY散点图

Heatmap

绘制起来要稍微麻烦一些，我暂时还没找到可以用Excel绘制Heatmap比较简单的方法或者程序包。为了简便起见，我选择了一个免费软件MeV (Multiple experiment viewer) 下载地址：http://www.mybiosoftware.com/mev-4-6-2-multiple-experiment-viewer.html

这个软件功能很强大，也可以用作Microarray data analysis，有包括HCL，K-mean Clustering 在内的好几种聚类分析方案，重要的是一键可用。好用虽然好用，但是前期的数据准备还是要在EXCEL里面先做好，这次用的是CPM，即上文提到的WT-CPM(-1,-2,-3)和lsd1-CPM(-1,-2,-3)。

a) 首先，算一下均值， “=mean(wt_cpm-1, wt_cpm-2,wt-cpm-3)”和“=mean(lsd1_cpm-1, lsd1_cpm-2, lsd1-cpm-3)”。如果，你的数据很多，比如在图D中，还有一个lsd1NahG,也可以算好均值，但是要注意的是，将每一个基因一一对应好，不要有错漏，有些基因可能在一个样本里没有检测到，而在另一个样本里有。那么基因样本的缺省值，可设置0.00000001，意即表达量极低，以至于不能检测到。也可以设置能NA，意为错误或缺省值。两种处理方式，在文章中都是可以接受的，但为了美观，我通常会选择前者。后者，用MeV作图时会出现一块灰色的区域。

a) 首先，算一下均值， “=mean(wt_cpm-1, wt_cpm-2,wt-cpm-3)”和“=mean(lsd1_cpm-1, lsd1_cpm-2, lsd1-cpm-3)”。如果，你的数据很多，比如在图D中，还有一个lsd1NahG,也可以算好均值，但是要注意的是，将每一个基因一一对应好，不要有错漏，有些基因可能在一个样本里没有检测到，而在另一个样本里有。那么基因样本的缺省值，可设置0.00000001，意即表达量极低，以至于不能检测到。也可以设置能NA，意为错误或缺省值。两种处理方式，在文章中都是可以接受的，但为了美观，我通常会选择前者。后者，用MeV作图时会出现一块灰色的区域。

计算每个样本的均值

b) 接着，把整理好的数据，复制到txt文档中，因为MeV只支持txt格式的文本文档数据。

c) 打开软件,File>load data ,注意软件左下方的红字：Click the upper-leftmost expression

value. Click the load button to finish.

b) 接着，把整理好的数据，复制到txt文档中，因为MeV只支持txt格式的文本文档数据。

c) 打开软件,File>load data ,注意软件左下方的红字：Click the upper-leftmost expression

value. Click the load button to finish.

MeV软件界面，导入数据

d) 依次点击Adjust data 选择

e)

d) 依次点击Adjust data 选择

e)

调整数据，对数据进行标准化

f)

f)

设置颜色限制范围

g)

g)

对基因进行聚类分析

HCL clustering可以用软件的默认设置，具体每一条什么意思，大家可以查询一下，解释起来很麻烦，而且也不是本文的重点。如果样品不是很多可以不用选Sample Tree. 具体的软件使用，可以参考软件使用手册，一定要读一遍手册！！！然后调整一下字体什么的，就做成图D了。

韦恩图

的意思一般是，找到两个或者三个样本之间相同的差异表达基因，比如与wt比较，样本lsd1中有很多LogFC>1的基因，lsd1NahG也有很多LogFC>1的基因，那么这些基因中有没有重叠的（Overlapped Genes）,这时就可以用韦恩图了。这时，用的就是GeneID,可以

a) 同时选中两列GeneID,用EXCEL中的“条件格式”>“突出显示单元格规则”“重复值”把重复值标记成红色选项,手动作图。

利用Excel中的条件格式功能做韦恩图

b) 也可以用现成的工具 http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/

这样 图B就做好了。

GO analysis

现在，我们已经把这些基因分类了，也Visualize了，其实这些炫酷的图基本没啥卵用的。也就是为了好看，告诉读者，我做了RNA-seq结果是这样的，给你看给你看，多好看啊！然而，读者肯定会一头雾水！这是个啥，啥，啥！！！！！为了解释这是个啥啥啥！我们就要对这些基因进行功能性分析，也就是Gene Ontology（基因本体论）从，三个方面

1) Biological Process （BP);

2) Molecular Functionv(MF);

3) Cellular Component (CC)，

1) Biological Process （BP);

2) Molecular Functionv(MF);

3) Cellular Component (CC)，

对这些基因进行注释，然后找到一些线索，为接下来的研究、设计实验做些准备。一些人开发了Excel分析包，我没用过，因为用于GO analysis的分析软件特别多。一款比较常用的就是 gprofiler: http://biit.cs.ut.ee/gprofiler/

这里用到的是GeneID

把得到的数据，以excel的方式存起来，打开文档把corrected p-value 用-Log10作一下转化得到-log10(p-value)，简单的按从小到大排一下序,然后选中term name，插入条形图，就可以做出图E。按颜色，把BP，MF，CC标出来。

利用Excel做出条形图，可视化GO分析数据，不同颜色代表不同功能类型 红色：BP，深蓝色：CC， 浅蓝色：MF

图F表述的意思其实和图E差不多，根据自己的需要可以做出选择，作图F用到的也是GeneID,不同的是，它是用一个软件Cytoscape:http://www.cytoscape.org中的App BiNGO做的，操作起来很简单，有兴趣的可以去下载软件自己去试一试，这里就不详细说了。

最后，还差一个图C,图C是干嘛的呢？图C学名Ratio -intensity plot

假如，有一些基因在mutant lsd1 里面是上调的（图C中全部为红色），那么这些上调的基因，在敲出一个关键基因以后，表达量会不会受到影响呢？这时候就要用到图C：密度散点图（Intensity scatterplot）,这里用到的值是“mean(wt_raw counts-1, wt_ raw counts -2,wt_raw counts -3)”和“mean(lsd1_raw counts -1, lsd1_ raw counts -2, lsd1_raw counts -3)”

首先，将两组数据的均值用log2做一下转换。然后选择转换后的数据，插入XY scatter，编辑一下X、Y轴就可以了。

还有一个类似的，叫做R-I (MA)plot,看起来像是把上述密度散点图旋转45°，也是一种比较初级的Normalization的方法，一般的用于全基因组基因可视化绘制，用的也是mean(wt_raw counts-1, wt_ raw counts -2,wt_raw counts -3)”和“mean(lsd1_ raw counts -1, lsd1_ raw counts -2, lsd1_raw counts -3)”，也做转换 不过不同的是：

I=log2(wt_mean*lsd1_mean)：作为X轴

R=log2(wt_mean/lsd1_mean)：作为Y轴

大概是这个样子的。

R-I 或MA plot

好了，如果你认真看完这篇貌似技术贴的水贴，那么就可以解决你的燃眉之急，解决一大半类似的数据分析问题了。

我现在也在学习R，以及Python。因为，要真正掌握生物信息学的精髓，这些是远远不够的。虽然我只是一只分子植物学喵！如果你能熟练运用R语言，那么做出以上图，将会更加容易。

最后，欢迎大家提出各种意见，欢迎各种姿势骚扰，交流学习经验。

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