用于研究细菌细胞的超分辨率荧光显微镜 |
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用于研究细菌细胞的超分辨率荧光显微镜
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过去二十年来开发的超分辨率荧光显微镜技术已将荧光标记分子的分辨率极限推至纳米尺度。这些技术有望以毫秒级的单分子分辨率研究细菌结构，例如分泌系统等大分子组件。在此，我们回顾了超分辨率荧光显微镜的最新应用，重点是细菌分泌系统。我们还介绍了 MINFLUX 荧光纳米镜技术，这是一种相对较新的技术，有望有朝一日捕捉到分子机器工作的动态过程。
 FIGURE 1 Approximate resolution of different fluorescence microscopy methods using the example of a Gram-negative bacterial cell with a ribosome and a type 3 secretion system (T3SS). (a) Schematic true-scale representation of a Gram-negative rod-shaped bacterium (1 μm width, 2.5 μm length) carrying a T3SS (~40 nm width, ~150 nm length) and a ribosome (~20 nm diameter). The ellipsoids represent the approximate resolution in x, y, and z for confocal microscopy, structured illumination microscopy (SIM), stimulated emission depletion (STED) nanoscopy, single-molecule localization microscopy (SMLM), and minimal photon flux (MINFLUX) nanoscopy. Approximate resolution values in 2D (blue) and 3D (green) mode of the indicated microscopy methods are shown. The T3SS, its translocon and YscL complex, a bacterial ribosome, and the 3D-MINFLUX sphere are shown enlarged in the insets. IM, inner membrane; PG, peptidoglycan layer; OM, outer membrane; HCM, host cell membrane. (b) True-scale representation of common molecules used for fluorescent labeling of target structures in relation to the 3D-MINFLUX nanoscopy resolution. Structures were obtained from the protein data bank (PDB): 1igt (IgG), 5dty (green fluorescent protein), 6i2g (NbALFA bound to ALFA-tag), 6y7a (Halo-tag), and 7k00 (bacterial ribosome).在这篇综述中，作者描述了近期关于SRM的工作进展，展示了荧光SRM对于诠释细菌中复杂的分子结构和功能的重要性，重点介绍了分泌系统。作者还特别关注了 MINFLUX 纳米透视技术，它是一种很有前途的方法，能以个位数纳米和低毫秒级的时空分辨率观察单分子的分子运动和动态相互作用。作者详细地介绍了 SRM 方法的应用，包括 MINFLUX 纳米镜观察分子机器--细菌 III型分泌系统（type 3 secretion system，T3SS）--的各个组成部分。虽然本综述的重点是细菌分子过程的可视化，但所有描述的显微镜方法也适用于其他细胞类型。荧光超分辨率显微镜（SRM）技术： 荧光 SRM 技术可实现远低于约 200-300 nm光衍射极限的分辨率和定位精度。其中，结构照明显微镜（structured illumination microscopy，SIM）是一种宽视场方法，用周期性（大多数情况下是正弦图案）激发光照射样品。当激发光相对于样品移动和旋转时，需要获取多张图片。基于傅立叶变换的算法应用于所获取的图像，以生成最终图像。线性 SIM 可将横向分辨率提高到约 120 nm，将轴向分辨率提高到约 300 nm。线性结构照明显微镜技术已广泛应用于细菌细胞生物学，例如，可改善不同分泌系统组件的可视化。 在生物系统成像方面，有两种分辨率低至 20-30 nm的荧光显微镜技术尤为成功。它们一方面是基于激光扫描的超分辨率方法，如受激发射损耗（STED）纳米显微镜；另一方面是基于宽场的单分子定位显微镜（SMLM）方法，包括（直接）随机光学重建显微镜（(d)STORM）、光激活定位显微镜（PALM）和纳米级地形图成像点积累（PAINT）。在这些情况下，单个荧光团的荧光发射随着时间的推移被定位在光的衍射极限以下。表 2 还介绍了 SIM、STED、SMLM 和 MINFLUX 的优势和局限性。
补充：二抗是指用于靶向结合一抗的抗体，经常和一抗结合使用以检测目标蛋白。 应用： 应用如图 2 所示： 
细胞壁和膜过程：破译革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌肽聚糖合成的精确时间和定位是分子细菌学的一个长期目标，在医学上可能具有重要意义。在一项研究中，以头孢菌素、代谢物和羟胺为基础的荧光探针与直接光学重建显微镜（d-STORM）相结合，揭示了金黄色葡萄球菌在生长和分裂过程中如何控制肽聚糖动态的分子细节。此外，光学重建显微镜（STORM）或结构照明显微镜（SIM）超分辨率荧光显微镜与原子力显微镜（AFM）的结合（分别命名为 STORMForce 或 SIMForce）揭示了枯草杆菌生长和分裂过程中肽聚糖合成的复杂时空三维动态。荧光标记的teixobactin（最近推出的一种抗生素）的SIM观测，使其在革兰氏阳性细胞壁中的相互作用和结构组织可视化。这有助于深入了解 teixobactin 的作用机制，并有助于开发具有类似特性的抗生素（图 2g）。  FIGURE 2 Selection of published super-resolution microscopy images and tracking applications. (a) Live-cell 3D-SIM showing dynamics of interbacterial contact-dependent type 6 secretion system component TssB-sfGFP (green arrowhead) in A. baylyi over 85 s. Scale bar: 1 μm. (b) Two-color 2D single-molecule switching nanoscopy showing separate locations of T3SS components mEos3.2-PrgH (green) and antibody stained SipD (magenta; Alexa Fluor 647) in S. typhimurium. Scale bar: 500 nm. (c) Two-color 3D-STED nanoscopy showing co-localization of antibody-stained Y. enterocolitica T3SS pore component YopB (red; Abberior STAR RED) and anti-GFP nanobody stained PIP2 sensor PLCδ-PH-GFP (green; Abberior STAR 580) expressed in HeLa cells. Scale bar: 500 nm. (d) 3D-MINFLUX nanoscopy showing distribution of the Halo-tagged Y. enterocolitica T3SS component YscL stained with Alexa Fluor 647 in xy-view. The z-axis is color coded. The white boxed area has a depth of 200 nm along the x-axis. (e) Trajectories of 3D super-resolution SMT of eYFP-labeled Y. enterocolitica T3SS component YscL. Blue trajectories: diffusion coefficient D* 0.5 μm2/s. (f) Trajectories of 2D-PALM SMT of the PAmCherry-labeled beta' subunit of RNA polymerases (RNAPs) in E. coli. Red trajectories: bound RNAPs. Blue trajectories: mobile RNAPs. Scale bar: 1 μm. (g) SIM micrograph of B. subtilis stained with Lys(Cy3)10-teixobactin. (h) Correlative SIM and FIB/SEM tomography revealing the three-dimensional structure of replicative Brucella-containing vacuoles (rBCV). Left: SIM of dsRed expressing B. abortus (magenta) infecting HeLa cells expressing the ER marker Emerald-Sec61β (green). Scale bar: 2 μm. N: nucleus. Middle: FIB-SEM tomogram of the boxed area marked in the left image. Scale bar: 1 μm. Right: 3D reconstruction of the area marked in the middle image, showing bacteria (magenta), rBCV membrane, and adjacent ER cisternae (yellow). Scale bar: 500 nm. 粘附蛋白和生物膜：光激活定位显微镜（PALM ）和直接光学重建显微镜（dSTORM）被用来研究支原体表面和细胞质中蛋白质的亚细胞定位。这些人类和动物病原体的基因组和体积都非常小，因此也是合成生物学的重要模式生物，超分辨率显微镜技术将极大地提高人们对其生物学特性的认识。我们使用 DNA-PAINT研究了金黄色葡萄球菌纤维粘连蛋白结合受体的组织以及对不同大小（100-1000 nm）纤维粘连蛋白斑块的粘附。结果表明，金黄色葡萄球菌的强粘附需要300 nm或更大的纤维粘连蛋白斑块以及两个或更多细菌受体的参与。 DNA 和 RNA 代谢：不同的 SRM 和 SMT 技术已被用于实时观察细菌 RNA 聚合酶（图 2f）、DNA 结合蛋白的活动、DNA 复制和转录的确切空间组织以及 DNA 修复过程。DNA 甲基转移酶（MT酶）在限制修饰系统、细胞周期调控和基因表达控制中具有核心功能。MT酶 DnmA 的 SMLM 和 SMT 揭示了它在核仁和复制体区域的优先定位及其胞内动态。 分泌系统中的荧光 SRM：细菌开发了不同类型的系统，可将分子分泌到细胞外空间或转运到宿主细胞内。细菌分泌系统可能由单一蛋白质组成，也可能由 20 多种不同的蛋白质组成，这些蛋白质组合在一起形成复杂的大分子机器，T3SS（type 3 secretion system） 就是一个例子。T3SS 也称为注射体，存在于包括假单胞菌和沙门氏菌在内的多种病原体中，可将毒力效应蛋白转运到真核宿主细胞中，可以操纵各种细胞过程，并最终决定了每种病原体与宿主的相互作用以及感染的结果。在一项关于 T3SS 的综合 SRM 研究中，用荧光抗体或光电开关荧光团 mEos 3.2 标记了鼠伤寒沙门氏菌中的各种 T3SS 成分，并用二维和三维 SMLM 进行了可视化（图 2b）。 展望： SRM和SMT 是快速发展的技术，有望在了解细菌细胞生物学方面取得重大进展。(1) 活体 STED 显微镜有可能对复杂细菌过程中的荧光标记分子成像，其分辨率比传统活细胞显微镜高五倍；(2) 荧光探针的新发展和优化（如开关特性、亮度），尤其是 MINFLUX 纳米透视技术的发展和优化，将提高该方法的多功能性和灵活性，例如在多色和活体成像以及 SMT 方面。(3) 将 MINFLUX 纳米镜与 PAINT 标记方法相结合，可实现三个或更多相关分子的并行成像。(4) 先进的分子标记方法也可能开辟不可预见的方法选择。 结合荧光 SRM 和（低温）电子显微镜（EM）优势的相关方法，即 CLEM，在提供细菌分子过程及其与宿主细胞相互作用的高分辨率数据方面也具有巨大潜力。电磁显微镜可以提供几乎所有细胞结构的无标记高分辨率数据，而荧光 SRM 则增加了特异标记蛋白质的定位和动态分析。MINFLUX 纳米镜中的跟踪模式以及 MINSTED 纳米镜等其他即将出现的潜在技术（可直接观察单个分子的运动）有望为复杂的分子活动提供全新的见解。 |
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