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冷冻并包埋组织： 冷冻样本以迅速保存RNA至关重要。 我们一般使用组织冷冻喷雾，如Cytocool II (Richard Allen Scientific) 瞬间冻结样本，但亦可使用液氮。 尽管未包埋冷冻组织也可用于冰冻切片，但我们推荐使用冷冻包埋基质 (如TissueTek O.C.T.) 包埋样本，有助于在切片过程中保存形态学特征。 在包埋组织时使样本保持冷却；使用一次性乙烯样品包埋模具在干冰上包埋冷冻组织。 冰冻切片组织： 用RNaseZap (Ambion) 清洁样品台，并涂上一层O.C.T.，将组织置于台上。 将样品台置于干冰内，在处理前使O.C.T.冷冻。 这层额外的包埋剂有助于防止在冰冻切片过程中，切刀将组织从台面上碰掉。 确保在冰冻切片前，将包埋组织平衡至冷冻台的温度。 最佳切割温度为–10至–60°C，具体取决于组织的脂肪含量。 在切片过程中使组织保持冷却，以免RNA降解。 如果在此过程中组织温度升高，则喷洒组织冷冻喷雾，快速冷却组织或仪器。 将显微镜载玻片盒置于干冰上，立即将切片的载玻片置于预冷的盒内。 如果在切片后立即进行染色，则更方便的做法是在开始染色前，先将其保存在低温恒温器内。 冷冻切片的玻片可以安全地冷冻，以供稍后使用。 在载玻片盒中加入一小包干燥剂 (吸附剂)，以实验薄膜密封，置于–80ºC下储存待染色。 玻片固定并染色： 为避免将残留的乙醇带到下一步骤，在吸附剂表面轻轻拍打玻片，去除多余的乙醇。 使用分子筛 (如EMD化学分子筛，4A型，8–12目微珠) 用于100%乙醇，减少水分积聚。 要获得出众的冷冻切片染色效果，同时保护RNA质量，供下游应用，请查看Ambion的LCM染色试剂盒。 确保冰冻切片样本充分脱水： 在开始LCM前，使样本充分脱水至关重要。 潮湿样本易受静水压力作用，LCM后难以从载玻片和周围组织中分离目标组织。 脱水不充分的样本一般半透明度更高，且表面更亮。
经常更换乙醇和二甲苯固定液。 如果您脱水时间较短时，脱水不充分，可以将乙醇/水溶液处理的时间延长至30秒，将100%乙醇处理的时间延长至1分钟。 增加10秒的二甲苯处理步骤，然后在脱水后利用二甲苯去除乙醇5分钟。 高湿度会对LCM实验产生严重影响。 如果在您设置过程中存在湿度问题，则使用湿度计监测室内湿度，并采用除湿器将环境湿度保持在25–45%范围内。 进行LCM并开始RNA提取步骤 载玻片固定并染色后，应立即进行LCM，将RNA降解程度降至最低。 使用胶条 (如Arcturus的Prep Strip™) 去除载玻片上的疏松组织，然后进行LCM。 采用胶条 (如Arcturus的Capsure Cleanup Pads) 去除热塑薄膜上的外源性组织。 要最大化微切割组织中的RNA回收量，采用尖镊子撕下Capsure LCM Cap (Arcturus) 上的热塑薄膜，将其扔至裂解液中。 从微切割组织中提取RNA 推荐使用Ambion的RNAqueous-Micro试剂盒，回收LCM微切割组织中的RNA。 该试剂盒是基于硅胶基质上的RNA固相提取。 过滤器的结构可实现RNA的少量回收 (~20 µl)。 试剂盒还包含去除污染的基因组DNA所需的试剂。
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