1、 植物保护研究技术 昆虫学关键研究部分 前言一、课程性质植物保护专业主干课程： 普通植物病理学、普通昆虫学 农业植物病理学、农业昆虫学 植物化学保护 植物检验检疫学 植物保护研究技术 昆虫生态与预测预报二、开课历史 全国最早开课：分昆虫研究法，植物病理研究法和植物化学保护研究法三门课。后合并为一门课。 三、内容范围 科学的内涵必须借助于方法和技术展现其本来面目。植物保护学的发展离不开各种技术科学，其中包含着一切技术科学所给予的支持：以昆虫学研究为例（1）昆虫学的研究对象在地球上无处不在；（2）很难发现究竟有哪些技术不被昆虫学所利用；（3）昆虫学研究方法是技术科学总体中的一个很小分支 研究法：技

2、术+方法技术 technique 或 technology，具体的实践， 属工艺范畴；方法 method 或 methodology，包含着某种设 计思想，引导科学实践的一种程序和规范， 属技术路线； 研究法，不是“实验大全”，也不是“技术手册” 植物保护学各类实验以及科学研究方法中抽象出的一般性问题。从世界上昆虫研究的发展来看经历了五个阶段：采集昆虫、制藏标本的观察阶段（observation stage）；分门别类、比较鉴定的分类阶段（classification stage）；控制环境、对比饲养的实验阶段（experimental stage）；综合结果、总结规律的理论阶段（theori

3、zing stage）；摹拟法则、制定公式的数理阶段（mathematical stage）。 随着生命科学日新月异的发展，一些新的研究方法、新的技术在昆虫学研究中有了广泛的运用，为我们了解昆虫的生活习性、对昆虫分类及生物防治带来了很大的方便。这些新方法新技术，包括生物化学技术、分子生物学技术、细胞遗传学方法等已被越来越多的生态学家、昆虫研究工作人员重视。 宏观微观的分子阶段昆虫学研究方法1、昆虫学文献2、昆虫标本及形态学、解剖学实验方法：昆虫绘图3、昆虫标本及形态学、解剖学实验方法：整体制片4、昆虫组织学和超微结构实验方法：昆虫组织切片及电镜在昆虫学中的应用5、昆虫摄影及显微摄影6、昆虫学饲

4、养技术7、昆虫生理学、生物化学实验技术8、昆虫分子生物学技术9、昆虫生态学及农业昆虫学实验技术 10、计算机在昆虫学中的应用 植物保护学文献检索一 文献检索方法1、常用法 检索工具查找文献 顺查法 从远到近，各年逐查 倒查法 由近而远2、追溯法 以文章后面所附的参考文献为基础，查找其它文献资料，滚雪球3、分散法 分期分段，采用上述两种方法二利用检索工具查找昆虫学文献通过一定的检索途径和方法 1、几种重要的检索工具 (1) 利用馆藏目录查找昆虫学文献 中国图书分类法 Q96 昆虫学、Q966应用昆虫学 图书目录：书名目录、 著者目录、主题目录 (2) 利用“名录”、“辞典”查找昆虫名称等 拉英汉

5、昆虫名称 1983年 科学院 中国农业害虫名录 1980年 中科院 (3) 检索工具查找昆虫学文献 国内： 全国报刊索引 分类途径查找 （Q. 自然、科学技术；T. 生物科学；V. 农业、林业） 科学技术译文通讯 题录形式分类 国外科技资料馆藏目录 中国科技情报所的文献、16个分册（农业、林业、水产、生物学） 全国总书目（年刊）、全国新书目（月刊）、科技新书目（季刊） 国内会议文献通报（季刊） 国外： 动物学记录 Zoological Record 1864， 伦敦动物学会， 1972年分成 21个分册，昆虫为13分册 著录格式：作者姓名、题目、期刊名称、卷期、页码、图表等 作者索引、主题索引

6、、地理索引、系统分类索引 (b) 生物学文摘 B. A.- Biological Abstract 1926年，110多个国家8686种期刊；1939年开始陆续分成12个分册，其中包括1970年分出的昆虫学文摘； (c) 昆虫学文摘 A. E.- Abstract of Entomology, 1970年 著录格式：文摘号、作者姓名、期刊名称、卷期、页码及年份 （如为非英语，则括号内注明原文文种及摘要文种）、题目（黑体）、文摘正文 作者索引、生物分类索引、类属索引 generic index、概念索引 concept index、关键词索引 subject index (key word)、组

7、配索引 cross index 2、计算机检索 外文资源：AGRICOLA 、 AGRIS、 CABI、MEDLINE 、 Ovid、ISI Web of Knowledge 等中文资源：CNKI 中国知网 （中国期刊全文数据库、 中国优秀硕士学位论文全文数据库、 中国博士学位论文全文数据库）万方科技、万方数据资源系统维普期刊 等ISI Web of Knowledge检索平台的 它集成了多个数据库，可以进行跨库检索，也可以选择单库检索。主要数据库有： 1Web of Science（科学引文索引），： 2Journal Citation Reports（JCR），期刊引用报告： 3Derwe

8、nt Innovations Index（DII），德温特世界专利创新索引： 4Essential Science Indicators（ESI），基本科学指标： 5INSPEC（SA）科学文摘： 6MEDLINE 医学文摘： CNKI为国家知识基础设施（National Knowledge Infrastructure）的简称，CNKI工程是由清华大学、清华同方发起，始建于1999年6月。 通过CNKI平台，我校用户可以检索并下载:中国期刊全文数据库（全文年限：1994年以后）中国优秀硕士学位论文全文数据库（全文年限：1999年以后）中国博士论文全文数据库的数据和全文（全文年限：1999年以

9、后）重要昆虫学文献一 常用昆虫学重要著作 国内：昆虫分类学（上）蔡邦华 财政经济出版社 1956昆虫分类学（中） 科学出版社 1973昆虫分类学（下） 科学出版社 1985昆虫生理学 王荫长主编 中国农业出版社 2004昆虫生理生化学 王荫长主编昆虫生物化学 王荫长主编 中国农业出版社 2001中国经济昆虫志中国动物志 昆虫学辞典 国外： Imms, A. D. 1977 General Entomology (textbook)Snodgrass R. E. 1935 MorphologyWigglesworth, B. 1972 PhysiologySouthword, T. R. E.

10、1978 EcologyRockstein, M. 1978 BiochemistryMathews, R. E. & Mathews, J. R. 1978 BehaviourKerkut & Gilbert . 1985, 13vols. Comprehensive Insect Physiology , Biochemistry and PharmacologyGilbert, L.I. (ed.) 2004，7 vols. Comprehensive molecular insect science 二重要昆虫学、植物保护学期刊：英文Ecological Entomology 生态昆虫

11、学，1976创刊，季刊，英国Insect Biochemistry and Molecular Biology 昆虫生物化学和分子生物学，1971，半季刊，英国Insect Molecular Biology 昆虫分子生物学，1992，季刊，英国Journal of Insect Physiology 昆虫生理学杂志，1957，月刊，英国Physiological Entomology 生理昆虫学，1976，季刊，英国Systematic Entomology 系统昆虫学，1976，季刊，英国Annual Review of Entomology 昆虫学年评，1956，年刊，美国Environ

12、mental Entomology 环境昆虫学，1972，双月刊，美国Journal of Economic Entomology 经济昆虫学杂志，1908，双月刊，美国Canadian Entomologist 加拿大昆虫学家，1868，双月刊，加拿大Journal of Applied Entomology 应用昆虫学杂志，1914，半季刊，德国Plant disease 植物病害（美）Journal of Phytopathology 植物病理学杂志（德）Phytopathology 植物病理学（美）Journal of General Plant Pathology 普通植物病理学杂志

13、（日）European Journal of Plant Pathology 欧洲植物病理学杂志（荷）Molecular Plant Pathology 分子植物病理学（英）Archives of Environmental Contamination and Toxicology 环境污染与毒理学进展（美）中文昆虫学报，昆虫知识，昆虫分类学报动物学报，动物分类学报，动物学研究植物保护学报，植物保护，植物检疫植物病理学报，昆虫天敌，中国生物防治农药学学报，农药，农药科学与管理、昆虫绘图 Drawing（一）绘图的目的和意义1. 什么是昆虫绘图？运用绘图这一特定的造型艺术手段（或方法），将昆虫体

14、的外部形态特征、内部解剖构造、细胞组织特征、生态环境要素、群体自然景观等内容，作科学和形象表达的一种有效形式，是以昆虫为主题的一种直观性的艺术语言，它是生物绘图的组成部分，是科学图画中的一个重要组成部分，是美学（绘图艺术）与科学（生物学）互相渗透的产物。2. 昆虫绘图不能取代摄影确实有长处：真实性、速度敏捷、复制周期短绘画的独到之处： 可以表达各个部分、重点突出、清晰 最大限度地表达科学的真实性，在损伤、变形、残缺、错位、相互重叠遮掩的部分，予以复原 根据科学意图，将各个部分加以恰当的组合，使之成为一幅完整的画面 器材设备相对简单 制版印刷工艺过程简单 出版部门欢迎绘图，成本低3. 目的和意义

15、 为科学研究提供形象化资料；加深昆虫自然信息的认识、理解； 促进昆虫学科与相关学科的信息交流和推广； 方寸之幅面，表达丰富内容：昆虫的主要特征和细微难辨的构造； 通过绘图实践，可培养悉心研究、认真细致观察的良好习惯，一丝不苟的工作态度，忠于科学、实事求是的优良学风； 可以给教学提供有效直观的效果4. 昆虫绘图的特点 以昆虫为题材、 遵从科学的真实性 绘图与文字有机结合、 服务于科学、科研和社会经济科学性准确，第一原则形态准确、比例协调、特征明晰质量感真实感厚薄、软硬、被毛或光滑、平整与粗糙、暗淡和光亮、光泽 具有一定的艺术效果生动，富于艺术魅力构图适当、姿态完美、合理用笔、色彩准确鲜明、层次适

16、当（立体感） 使用效果符合印刷要求（大小、线点） 画面必须保持整洁（二）生物绘图的种类1、表现题材的性质来分 个体外部形态特征图分类学、形态学 内部解剖构造图形态学、比较解剖学、分类学 显微玻片标本图细胞学、组织学、超微形态学 示意图解说性示意图（生命过程、物质运转、相互关系） 生态景观图个体或群体生活习性内部解剖构造图昆虫消化道结构图生活史示意图2、使用范围来分 供印刷出版的描图、图版要求高 留作科研形象记录的资料原图 教学挂图幅面大、线条粗、重点突出、表达清晰 科学普及宣传图形象生动、深入浅出、多为各层次群众所接受3、从表达形式来分 黑白图以白纸为底，单一黑墨绘就点线图锌板图（凹凸）渲染图

17、铜板，黑白层次 彩色图水彩、油彩、水粉等4、从绘图方法来分 实体描绘 显微描绘 拷贝昆虫黑白点线图 引自李琦（三）黑白点线图1、工具铅笔（3H、H硬笔为好），橡皮，绘图笔（水钢笔），双面刀片等2、材料绘图纸，透明纸（硫酸纸），方格纸，墨水（碳素墨水）3、设备观察板、圆规、九宫格、方格片、描绘仪、双筒镜、描图架、直尺（四）绘图步骤准备起稿定稿成图整饰1、准备 物质工具设备、材料、实物标本 业务知识昆虫专业知识 + 绘画技术2、起稿绘草图、打轮廓绘草图方法： 直接蒙绘大型平展昆虫，如蝶蛾 反射描绘大型平展或不平展昆虫，如蝶蛾、甲虫、蝗虫 尺规测绘 大、中型昆虫， 如甲虫、蝽象等要领：标定好基准线及

18、点的位置 （0、1、2、3、5）， 其次是找到适合的待测点 （10、11、12、14、4） 方格放大 采用透明塑料放大格，平放在虫体上，通过方格观察虫体，再画到绘图纸上相应的方格中去 投影放大 使用照象底片放大机、幻灯机、投影仪、显微投影仪、电视转播设备被放大的实物必须作成平板形透光体或幻灯片形式 复印机绘图（缩微阅读复印机） 绘制昆虫翅脉图，待绘标本须加工成平展、整洁、不留杂物污物 摄影绘图 先将昆虫拍照，洗印出放大的黑白照片， 再用蒙绘法勾画轮廓及形态摄影绘图法按像片图象用碳素墨水画出轮廓图。凉干后，放入碘液中至褐色，约15分钟 清水冲洗 大苏打液5分钟褪色 冲洗，晾干，则可得转绘的图像一

19、张。绘图仪阿培式绘图仪 （Abbecamera lucida）绘图仪附件 （Camera lucida）主要由两个直角棱镜合成的立方体和一个反光镜，在两个棱镜的胶合钭面上涂有银镜，中央为透光孔Leica-MZ125-电子成像系统 王漫漫拍摄ZEISS-Stemi-SV6-绘图仪王漫漫拍摄注意事项：安静、耐心，一气绘成，中途不能停顿背面图头向前；侧面图头向左 对称图只画半面；copy 完全对称虫体对称、正反面特征都要画的昆虫，如蚧虫标本大而镜子视野小，分几部分画，拼凑 标本位置不好，整姿不好，科学修改 拼凑和修改时，硫酸纸蒙着从绘图仪上描绘来的草稿草图上画错的线条，修改过的地方，橡皮擦干净，或作

20、出标记 图的大小，起稿前应“心中有数”，印刷的版面的2-4倍草稿上应立即注明昆虫名称（或编号）、绘图方法、放大倍数 爱护标本要求：1、图的排列：背面图，头向上；侧面图，头朝左。2、所绘的图都要有文字说明，图的各部分要注字，以虚线引出线条不得交叉，字要端正清楚。3、图的大小应与报告纸相适应，虫体各部比例要相称。4、所绘的图要力求与标本相像，并正确，在图上要能明确的绘出虫体的特征部位。5、图在报告纸上的排列位置：绘图时应注意图的数目在纵横上的排列，如绘三个图时，应排列成品字形，而不应倒品字形。总之，应以美观为原则。3、定稿全面校对、审定，修正、补充，标注4、成图上墨或着色过程 碳素墨水、绘图笔 点

21、线表示光线、浓淡、分界、凹点 线条细而均匀，两边光滑，点要点得圆、匀，粗细、疏密应符合虫体的明暗要求5、整饰剪贴标注比例尺法、数记法(X2)、示例等图序、图注修饰 软橡皮擦、揭除、刀刮、白粉涂盖用于生物分类学研究的显微成像新技术UV-C光学共聚焦显微图像系统集成了光学和数字图像分析技术，适用于采集非平面样品（高度变化范围超过了显微镜景深范围）的图像，可解决传统光学显微镜成像时高倍数与大景深不能共存的问题，使样品的不同高低部位都能清晰成像。UV-C系统由光学显微镜、专用光源、数码成像设备、专用图像处理软件、高性能计算机组成。通过调节显微镜达到样品的不同聚焦面，因为样品表面的高低变化范围超出了显微

22、镜的景深范围，所以在任何聚焦面的图像都只有局部是清晰的，将所有这些图像用数码成像设备记录并传输到计算机，然后交给UV-C的专用图像处理软件分析，最终即可合成出一幅全部清晰的高品质图片。、昆虫整体及局部特征制片（一）昆虫制片1. 什么是昆虫制片： 非切片法 整体制片（不一定是整个制片，可以局部器官的封片，如足、触角、翅、外生殖器） 涂片法血液 压碎法染色体、昆虫病毒、细菌等 浸渍分离法内脏、肌肉等 切片组织切片法徒手切片 石蜡切片 冰冻切片 超薄切片法电子显微镜 2.目的意义形态特征、鉴定内部器官、组织、细胞等构造病理、生理变化 （二）昆虫整体制片 从化石、琥珀得到启发而进行，此玻片可以永久保存

23、（太阳不能晒），一般可以保存10-70年。 1、要求 材料透明，光线可以通过，显微镜可以观察 不含水份（脱水彻底） 封固剂材料及透明剂的折光率与玻璃折光率一致加拿大树胶 1.52 玻璃1.518 2、制作工具载玻片 Glass slide常规：标准75 X 25mm，边缘光滑；特殊规格 50X25、75 X 37、75 X 50mm厚度：，平均1mm，油镜下观察，暗视野照像；要求：化学药品不腐蚀的玻璃特殊：凹玻片 Hollow glass，雄性外生殖器等 盖玻片 Cover glass形状：方形 长15、18、20、22mm 长方形 50 X 24mm 圆形 直径15、18、20mm（国内无）

24、厚度：0.07-0.13高倍油镜 0.13-0.17次高倍油镜 0.17-0.25中倍油镜 0.25 低倍油镜要求：厚薄相同（进口）、无花纹、无气泡、保存时应放入干燥器或洗干净浸入75-95%酒精（Alc）中解剖针、刀、圈针、尖头镊子、玻片镊子解剖针圆竹或玻璃棒 + 0或00号昆虫针解剖刀医用，或用剃须刀片自制圈针圆竹或玻璃棒 + 昆虫针（弯头） 染色皿、染色碟、培养皿、小烧杯（1套）、酒精灯等3、玻片制作的步骤 常规制作、快速制作、 直接制作A.常规杀死浸软水洗脱水染色透明封固标签杀死Killing水生昆虫热水，水合乙醛陆生昆虫乙醚、氰化物、热水、冷冻、乙酸乙酯等解剖生理盐水，0.85%Na

25、Cl 或在水中（蒸馏水）浸软和净化 Soaking & Cleaning通常5-10% KOH 、微小昆虫 3-5%NaOH除去内脏、肌肉、脂肪等，退色时间，凭经验 昆虫类群有关昆虫大小有关，体壁厚薄有关方法：浸几小时几周 或 水浴加热 水洗 Washing with water操作要仔细，以免将材料冲掉流水冲洗 Running water or tap water冲洗要彻底，洗尽KOH或NaOH；有时可以加点10%HCl中和碱性吸管冲洗：吸管吸水冲洗 脱水 Dehydration使组织中的水份完全除去，并使组织变硬，否则会影响后面的染色、透明超薄切片，丙醇（电镜）其它切片，酒精（乙醇Alc）

26、，梯度 30%50%70%85%95%100%染色皿 中染色 Staining不是所有材料都要染色；标本透明度一致，不同组织和部分分界不清时，染色使之分清染色剂种类：a.酸性复红（品红）（盐酸蔷薇苯胺） 70-75%Alc作溶液，浓度2%b.固绿（快绿）fast green，效果好，10年不退色、 95%Alc溶液，浓度2%c.硼砂洋红 Borai Carmine4%硼酸水溶液100ml + 洋红2-3g（胭脂红，来源于蚧壳虫，8万只雌提取1磅）煮30分钟加水保持100ml + 等量70%Alc24小时过滤染色时间：3-4天，酸Alc(酒精中滴醋酸) 鲜红色d. 酸苏木精液 Ehrlichs

27、haematoxylin进口苏木精染色方法：脱水70%时染色深兰黑色e. 氯唑黑E Chlorazol Balck几丁质染色 70%Alc饱和液脱水至70%Alc时，染色，2090%Alc冲洗95%细胞核黑色细胞质灰色几丁质黑绿透明 Clearing 使组织中的酒精（或丙醇）被透明剂所代替（使石蜡很顺利地进入组织中），增加组织的透明度（折光率），并能和封藏剂混合二甲苯、香柏油、苯、丁香油、松节油、木馏油、松节油+木馏油（1:1）、石碳酸+二甲苯（1:3或1:1）、酸、二甲苯+丁香油（3:1）等 一般用二甲苯丁香油、松节油、木馏油等可用于快速封藏，将组织直接加入，2-4天，取出过二甲苯，封藏封藏

28、 Mounting加拿大树胶 Canadian Balsam, 100g/100元，冷杉树，二甲苯作溶液中性树胶，国产100g/16元，不太稳定冷杉胶 贴标签反贴，左侧，背面注意事项a. KOH或NaOH浸软清除后，大材料流水冲洗，小材料吸管冲洗，b.脱水酒精要贴标签，加盖，防止蒸发c. 染色时染色剂浓度与脱水浓度一致d.移动小虫子时，要用圆针，不用镊子e.脱水时，尽量少带下一级浓度Alc到上一级，尤其在90%以上f. 标本在二甲苯中不可太长g. 封片要在晴天进行，或酒精灯上h.避免呼吸时的气泡i.盖盖玻片时，尽量防止气泡进入j. 树胶的量凭经验，不要太多，也不要太少k.注意材料在玻片上的位置

29、，应在中间l.封藏好后的玻片要平放在玻片架上，自然干燥或干燥箱内烘干B、快速和直接法 （小虫子和蚜虫）a.快速 材料 木馏油，1-2天封片b.直接封片 Hoyers液，在玻片上自行干燥 (Hoyers液配方：阿拉伯胶 15g , 甘油 10ml , 水合三氯乙醛 100g , 蒸馏水 25ml) 、昆虫组织切片及电镜应用一、石蜡切片（石蜡制片法，Paraffine method）1.用石蜡作浸透剂，做组织切片2.切片的厚度一般在2-10（10-6m），也可达(电镜可达50 m，即500A）3.用于组织学、胚胎学、细胞学、病理解剖学等4.虽然电镜应用越来越广，但石蜡切片还是不可或缺的5.组织切片

30、可用X光分析二、制作过程活体上切取组织固定冲洗（将固定液洗掉）脱水（梯度Alc）透明（去掉酒精）浸蜡透入（低高溶度蜡）包埋切片贴片脱蜡复水染色）脱水透明封藏标签1、杀死和固定 Killing & fixing杀死：可用乙醚或三氯甲烷麻醉，或用氰化钾快速杀死固定：防止自解，细胞中物质不解体、细胞组织不皱缩固定液：穿透力强，速度快，中止新陈代谢作用防止生物自解、保持标本组织细胞结构尽可能保持活体状态对组织化学分析起到媒染作用 实质上：与蛋白质结合沉淀，蛋白质变性 固定液种类 Fixative 种类很多，有单成份的，更多的是复合的 醋酸 Acid CH3COOH杀死快，穿透率强，对原生质，线粒体等起

31、破坏作用，保存染色体，沉淀核蛋白、糖蛋白；但使组织膨胀、柔软固定浓度：50%，1hrs （17时结冰）升汞 Bichloride of mercury, HgCL2 7.4%饱和液常用饱和；良好固定液，穿透力快，可沉淀所有蛋白；但使组织收缩、发脆，染色效果好酒精 Alchol, CH3CH2OH 70-100%穿透力快，沉淀蛋白，常用的脱水剂；但使组织收缩，染色困难，与铬酸、铬酸盐类不能混用福尔马林 formalin, HCHO 30-40%甲醛固定液浓度 4-10%穿透力快、速度较乙醇慢；组织收缩显著，但均匀，染色效果好，可以单独使用苦味酸 Pieric acid, C6H3(NO)3OH

32、饱和溶液浓度（易爆）杀死快、穿透力强、组织发硬，收缩逐渐进行；与福尔马林混用，可以增强穿透力，若再加醋酸可减少收缩布安氏液 Bouins fixing fluid 世界著名固定液苦味酸 75 福尔马林 25醋 酸 5杀死快、穿透力强、组织不硬化、收缩，易染色（尤其是苏木精）固定材料注意事项a.组织材料必须新鲜b.切取材料时注意方向c.切取用刀要锋利，切忌挤压d.取材大小，一般大小组织学 0.5 X 1X 1 cm，面积不超过1cm2细胞学0.5 X 0.5X 2 cm，面积不超过2e.材料与固定液 1:20f.固定材料要写清楚标签2、冲洗流水冲洗 70%Alc保存酒精冲洗 70%Alc保存目的

33、：将固定液全部冲洗掉，如Bouins液黄色3、脱水 Dehydration去掉组织内水分，梯度Alc 30%, 50% 75%, 85%, 95%, 100% Alc每级脱水时间与材料体积大小成正比脱水过程需中途停止或过夜，应在70%酒精中4、透明 clearing二甲苯、苯、甲苯、氯仿、香柏油、丁香油、苯胺油脱水石蜡进不去脱水100%Alc二甲苯可以100%Alc:二甲苯3:11:11:3脱水要干净，若不干净，组织中有空洞，半乳白色5、透入（透蜡）infittrating石蜡有熔点 melting point （m. T ）熔点低，石蜡软；熔点高，则硬；一般在42-56（2一档） 熔点强度与

34、切片厚度的关系 切 片 室 温 3-5 5-8 8-10 13-16 56 54 52 17-21 60 57 54 22-24 64 60 60 做切片标本时最好的气温是5-10月份。透蜡要求：石蜡渗入到细胞各个部分，连气泡部分也应渗入气泡中；石蜡要与组织完全成为一体，不可分离石蜡：二甲苯 1/4：3/41/2：1/23/4：1/4石蜡（100%）熔点：50525456，每级15-20分钟，2小时完成石蜡洗涤方法：热水 稀硫酸、或二甲苯6、包埋 embedding石蜡完全渗透，移入包埋用纸盒（高1cm），然后冷却，组织则包埋于蜡中。包埋过程中可能会出现白色小颗粒情况，象雪花一样，这可能：包埋

35、前：a. 脱水不干净b. 组织内或石蜡内混有透明剂c. 石蜡本身质量不好（欠佳）包埋中：a. 组织块移入时，包埋盒中石蜡已凝固；b. 移动组织块时，包埋盒中石蜡已凝固；c. 石蜡冷却慢，需要骤然冷却（通常放入冷水）7、切片 Sectioning切片机种类 microtome旋转式（摇动式，轮转式等）、滑行式切片刀 microtome knifea.双面刀 单凹面刀 双凹面刀 （常用） （火棉胶） （不常用）b.刀片锋口应在100X显微镜下观察无裂痕c.磨刀石，油石，天然（外国进口），磨刀时，应在磨刀石上放些石蜡油或肥皂水d.保存，用二甲苯擦干净保存修整 Trimming石蜡块底面正棱形、方形切

36、片a.准备工作b.蜡块（修切好的蜡块）装在台木上c.调整切片的厚度，先厚后薄，4-6，1-2d.放上刀片，调节蜡块与刀面平行e.慢慢使蜡块靠近刀片f.切片刀与蜡块角度，双面刀9-12，（7-12）g.切片的速度40转/分，左手持毛笔，把蜡带（拖）抬起8、贴片将切下的石蜡带粘贴在载玻片上蛋白粘片剂，梅氏 Mayers Albumen 配制方法： 蛋白（鸡） 50ml + 甘油 （丙三醇） 50ml+防腐剂（麝香草酚、水扬酸钠各1g）反面光滑、有光泽；放在水浴锅上，50，低于石蜡溶度3-5，使石蜡片展平；并不断滴水（蒸馏水）9、脱蜡及复水在染色缸中进行，脱蜡（二甲苯），20左右（与室温有关）复水1

37、00%Alc:二甲苯（1:1）100%Alc95%Alc 蒸馏水10、切片染色a. 染色目的： 因为生物组织、细胞内含物都是淡色，透明的，不易观察，有的会看不见，而且目前生物化学的发展，对生物组织的染色要求越来越高，通过染色，不同的部分染上不同的颜色。b. 染料分类 来源分 天然染料：苏木精、洋红（胭脂红、片红），靛青 人工染料：煤焦油染料，苯胺，苯衍生物（芳香族）化学反应 碱性染料：溶于水和Alc中，色碱盐、氯化物，硫酸盐，醋酸盐等 助色用-NH3，-N 如苏木精，番红，美兰 酸性染料：溶于Alc和水中，色酸盐、钠钾钙盐 助色用-OH，-COOH，-SO3H硫酸基 如伊红，亮绿，深红，复红

38、中性染料：酸碱染料相混而成，也称复合染料，如芮氏Wright染色剂、Giemsa染料注：作用基团是酸性或碱性染色对象 细胞核：苏木精、胭脂红、番红、结晶素、孔雀绿（碱） 甲苯胺兰、美兰、甲基绿 细胞质：伊红Y，淡绿，桔黄G，酸性复红，快绿，苦味酸，（酸） 水溶性苯胺兰 脂 肪：苏州、，苏州黑c. 染色原理与工业上染色差不多，有化学学说、物理学说；由于1945年以来，组织化学的发展，认为化学物理作用的综合物理：毛细管渗透作用 组织、吸收 吸附作用（分子引力作用）化学：细胞内，有酸、碱部分，如核酸往往与碱性染料有亲和力，细胞质则通常与酸性染料作用 蛋白质（两重性）：在酸性溶液中，显碱基性，与 “-

39、” 结合 在碱性溶液中，显酸基性，与“+”结合溶液PH值高于组织等位点，组织酸性，则与碱性染料结合 溶液PH值低于组织等位点，组织碱性，则与酸性染料结合d. 媒体向导有些染料，没有媒染剂，无法染色；媒染剂即能与生物组织作用，又能与染色剂作用，一般都是沉淀作用通常是铝盐、铁盐（明矾）e. 染色方法渐进染色法 progressive method 由浅深后退法 retrogressive method 由深浅（退色）所有染色程序：先染碱性酸性 苏木精 伊红 （核） （质）11、封藏12、标签三、电镜在昆虫学中的应用1、应用a.超微形态学 ultra structureb.组织学、细胞学、发生学、遗

40、传学等，细胞器、染色体、精细胞、卵细胞等，电镜细胞化学技术c.生理生化、病理学等，如病毒、细菌的观察和检查； 免疫学 免疫电镜技术 电镜放射自显影技术等d.昆虫生物大分子结构等e.图版2、原理和方法（1）电镜简介透射电镜 Trasmission electronic microscopy, TEM 以高能微束电子流穿透样品，经过样品内结构散射，再聚焦而成像扫描电镜 Scanning electronic microscopy, SEM利用高能微束电子流轰击样品表面，使之发出多种信号，再收集其中某种或某些信号加以处理放大而成像共同点：两者都以高能微束电子流作照明源不同点：对样品的处理上不同TEM

41、 要求对样品作电子染色处理（加强结构散射）、包埋、超薄切片等SEM 则要求对样品作导电处理，喷涂金属、组织导电技术等（2）样品制备a.透射电镜（超薄切片）取材固定冲洗脱水浸透包埋切片染色观察新 前后 磷 丙 环甲 500A 铜 鲜 二 次 酸 酮 氧基 玻 网 戊 四 缓 树丙 璃 电 二 氧 冲 脂稀 刀 子 醛 化 液 酸 染 锇 色 醋酸铅液b.扫描电镜直接使样品带电临界点干燥法：材料洗净固定洗净脱水（逐级进行）O2/（液汽）干燥镀金观察固定：10%戊二醛，1小时 1%锇酸，2小时脱水：丙酮喷涂：导电处理，一般用真空喷涂法，在高真空中以大电流、低电压、加热喷涂金属（黄、白金），形成100

42、-200A厚的金膜而导电，喷涂后即可观察例：白背飞虱触角感器扫描电镜观察引自孙虹霞等白背飞虱触角感器扫描电镜图St：毛形感器Sc：刺形感器Sa：耳状感器引自孙虹霞等，2006白背飞虱触角上菊花状的感器簇 引自孙虹霞等，2006每个感器簇由23-33个毛形感器和耳状感器聚合而成，感器紧密排列成圆形.昆虫饲养技术Insect Rearing一、昆虫饲养目的及方式1目的： 生物学（生长、发育、生殖）研究 行为学（行为、习性）研究 生态学（温、湿度、光照与生长发育的关系、寄生与天敌关系）研究 昆虫生理学等研究 杀虫剂药效的研究 昆虫标本的收集 生物防治大量释放天敌等2方 式完全饲养 生活史 卵成虫卵部

43、分饲养 某个阶段 幼虫蛹， 蛹成虫卵室外饲养 自然状况条件下进行室内饲养 人工控制条件下进行大规模饲养 （大量繁殖）单种饲养 天然饲料饲养 以昆虫自然条件下最喜爱取食的植物饲养人工饲料饲养 按昆虫营养、习性而配制的各种配制饲料饲养二、饲养观察的设备和器具1饲养室（养虫室）田间养虫设备养虫室 在昆虫发生区或邻近处，有树荫，生态条件较好。其内有水电、光照设备，地面为地板结构，有工作室；纱网16-18孔网（目），（每平方英寸孔数）大养虫笼(2)生化培养箱和人工气候箱 自动控制温度、光照、湿度(3)人工气候室(4)温室 室内水电、光照，加热系统2. 饲养器具及材料木质有吸水性、养虫笼不油漆(2)玻璃、

44、塑料、有机玻璃 透明、透光；无吸水性，易积水，太阳晒则升温指形管 0.84，18，1.58，28，412cm培养皿 6，10，15cm广口瓶、玻璃罩、水槽(3)金属材料坚固，不透水，无吸水性。(4) 陶器盆载、罐（越冬虫态）(5)纤维材料 脱脂棉、棉布、纱布、吸水纸其它工具：自行设计， 毛笔，镊子，解剖镜等三、饲养小气候因子的测定和控制温度、湿度、光照、风速、蒸发、土壤含水量1温度 1535，2025 温度计、高低温度计、温度仪 加热：灯炮、电炉、空调、取暖器 降温：冰水、空调 恒温：培养箱、生化培养箱、人工气候箱2、湿 度 更为重要、也更难控制 首先了解是否喜湿（苍蝇等双翅目幼虫喜湿） 湿度

45、不能太低，不能存活；太高易感染疾病 干湿球温度计、毛发湿度计、自计湿度计增湿空气中洒水降湿生石灰、浓硫酸、氧化钙恒湿空调（或饱和盐溶液），人工气候室（箱）3光照60W白炽灯、日光灯短光照能引起很多昆虫滞育。对长日照昆虫，饲养光照控制在14-16小时；仓贮害虫可在黑暗条件下饲养4风速 通风设备5土壤含水量 土壤害虫 仓库害虫 四、 饲养的一般技术和方法昆虫习性，要仔细观察，那怕是十分细小的细节，也要注意。如盲蝽，吃棉花叶的同时，要吃蚜虫蜜露等1 成虫补充营养天然饲料：植食性昆虫，甲虫、蝗虫（玉米、麦子等）；寄生性昆虫（虫）人工饲料：液体或半液体，水、蜜糖，血液、牛奶固体：双、膜用水果、干果、或（

46、琼脂10%100ml+20g蔗糖+50g蜜切成条状）2、交配产卵（成虫）往往是难关飞行中交配：蜻蜒、双翅目、膜翅目、蝶，饲养空间要大静止时交配：蛾类，产卵要求场所，如草、纸（如粘虫，蚕等）蝗虫等土壤蚊水玉米螟等干燥、3、卵期 温度，保湿 虫期保存卵期冷贮（冰冻），4、幼虫 食料新鲜，定期更换 没有相互残杀（密度适合） 高龄时，取食量大 卫生清洁5、蛹 化蛹习性，是否入土化蛹、结茧供以纸条 双翅目、鞘翅目沙土；蚊水 化蛹时，不能动6、饲养时的消毒和清洁工作a.干热：160,1小时b.湿热：蒸气高压锅，25大气压，20分钟 要放冷空气c. 金属： 1：50漂白粉，墙用石灰水刷白d. 室内有条件用紫

47、外灯灭菌 或用消毒液清洁e. 养虫时注意螨及其它天敌f. 各种器材（包括棉花、土壤都要消毒等）寄生性天敌昆虫人工饲养技术随着害虫生物防治重要性的显现，对害虫寄生性天敌的需求日增，由此引发了研究寄生性天敌人工培养的热潮，涉及的寄生天敌包括外寄生蜂，卵寄生蜂，幼虫内寄生蝇和蛹内寄生蜂。如，成功地从卵一直饲养到成虫的一种卵寄生蜂赤眼蜂（Tricogramma）。最早采用的方法是：在天然寄主上繁殖寄生性天敌最成功的例子是：卵寄生蜂，如赤眼蜂先用柞蚕卵制成卵卡暴露给赤眼蜂被寄生的卵卡释放到田间赤眼蜂成虫羽化出防治田间害虫方法虽然有效，但成本高昂：首先必须大量种植害虫寄主植物饲养目标害虫取得寄主卵做成卵卡

48、寄生蜂寄生利用人工饲料在寄主体外培养寄生性天敌的研究始于1915年，但直到1954年，美国昆虫学家House第一个用化学成分明确的化合物配制的人工饲料，成功培养出了一种石蝇Psudosarcophaga affinis Foll.。人工饲养寄生天敌的好处：实用性方面，工厂化、商品化，大规模生产使成本下降为寄生性天敌的生理生化研究提供了有效的平台使调查化学农药对寄生性天敌影响的工作变得更加简便易行人工饲养寄生性天敌的研究方法和技术主要包括：寄生性天敌卵的提取，三种方法（1）吸引并激发寄生性天敌直接产卵于人工寄主体内。首先要造出与寄主形态相似的人工寄主（蜡或是塑料薄膜作为制造材料）；其次，注入人工

49、寄主体内的液态物质除了能吸引并激发寄生天敌产卵外，还能为寄生天敌的胚后发育和幼期发育提供必需的营养（2）从被重寄生（superparasitism）的寄主中取卵。应用最广的方法是将少量寄主暴露给大量的雌性寄生性天敌，然后解剖被寄生的寄主，能获得大量的卵一般获取处于胚胎发育后期的卵（在寄主体内发育了20-24h）比较普遍，其在人工饲料中的孵化率接近100%（3）直接从雌性寄生性天敌的卵巢中取卵此法简便易行，但有一定的局限性。一是卵巢中的卵尚未授精，只能产生雄性的后代；二是因为卵巢中的卵没有经过产卵器的物理性挤压而无法发育此种方法一般不被采用人工饲料的配制获取足够的卵以后，最关键的下一步是人工饲料

50、的配制，而人工饲料的营养成分种类和比例是关键的关键因为一般寄生性天敌（尤其内寄生性天敌）的卵所含营养很少或完全没有，其生长发育所需的营养主要依靠其寄主寄生性天敌所需要的各类化合物：氨基酸和蛋白质类脂化合物甾醇类化合物碳水化合物维生素及其他特异的生理生化营养元素无机盐类化合物五、饲养记载详细、及时、准确1成虫（A）：羽化、活动、趋性（光、化）、交配（次数）、产卵（数量，场所，方式等）、性别、寿命、补充营养、习性差异、天敌2卵（E）：寄主（产卵）、排列、覆盖物、卵色变化、历期、孵化率、天敌、孤雌生殖等3幼虫（L）：孵化时期，卵壳（是否掉）开始取食时间、取食部位、 取食量（高、低）、量与气候关系、高

51、低龄食量差别、脱皮次数、头壳、体长变化越冬幼虫习性、滞育、对光反应历期、天敌、拟态4蛹（P）：化蛹场所、茧（茧、土茧）、蛹期长短、蛹色变化、死亡率、羽化期5越冬：场所、时间昆虫生活史的科学记述方法1、文字描述法 早期常用的方法如：棉绿盲蝽 2、公式法引自彩万志，20013、表格法4、图示法六、人工饲料80年代，昆虫营养。80年代后发展很快，这与生理、毒理、病理有关，与农药治理问题、生防、遗传不育、引诱等研究，需要整齐划一的昆虫1目的： 大规模饲养天敌、资源昆虫 新技术防治害虫 微生物防治害虫 杀虫剂筛选 信息素等生物测定 昆虫营养生理学研究2类 型 基础是营养学昆虫营养蛋白质、脂肪、碳水化合物

52、动物一样 甾醇、不胞和脂肪酸 维生素类，A、B、C、D、E等 类型全纯饲料：化学药品配，无生物物质 往往用于昆虫营养研究 成本高，饲养效果难达到自然生长的水平半纯饲料：化学药品为主，加来自植物/动物/微生物物质（未经提纯的粗制物）如植物组织，肝，酵母等往往实验室内研究中饲养昆虫实用饲料：加入寄主植物成份配制而成，如大豆、大麦胚（半合成饲料）往往用于大规模饲养 要加防腐剂，化学防腐剂 饲料有的要做成一定形态，如纤维状。成本低，配法简单，但饲料中各营养成分的比例较难掌握 配方： 忻介六 教科书例：粘虫的饲料组成（克）大豆粉；啤酒酵母；干酪素；纤维素粉；玉米叶粉；蔗糖；琼脂；胆固醇；抗坏血酸；山梨酸

53、；对-羟基苯甲酸甲酯；自来水120ml、昆虫生理生物化学实验技术昆虫生理学的范围很广，其实验技术也随之而涉及各个领域。主要：.昆虫血淋巴的一般操作技术 .昆虫电生理技术 .昆虫内分泌学及激素实验技术 .同位素技术（在昆虫生理研究中的应用） .检压技术（呼吸系统，呼吸量的检测） .取食量、食物利用率测定（消化系统）一、昆虫血淋巴的研究方法血淋巴 ： 血细胞类型：原血胞Prohemocyte 浆血胞Plasmatocyte 粒血胞Granulocyte 珠血胞Spherulocyte 类绛血胞Oenocytoid 血浆1、血细胞的研究血细胞的观察方法.活体观察 借一些昆虫身体的透明区，如翅或附肢等

54、，将其浸于甘油或镜油后以薄的盖玻片夹住，在高倍显微镜下观察，可见血细胞在其中循环。此法对翅厚、血淋巴少或血细胞小的种类效果不好，有很大局限性。.体外染色法 应用十分广泛 (1)固定与取血 因昆虫血液易于凝聚，往往在制成血涂片前已聚集成团而导致形态失真或无法计数，因此最好在取血前先行固定。方法：（i）温度固定。将昆虫在55-65热水中浸泡1-10分钟后取血滴于载玻片上，用盖玻片将血滴推拉成薄膜,凉干后染色。 （ii）化学固定。直接将昆虫血淋巴滴入化学固定剂（5%福尔马林或的戊二醛)中，血淋巴充分混匀后制成血涂片空干，染色前要将固定液漂净。(2)染色 方法很多，其中以Giemsa染色效果较好，且操

55、作方便。Giemsa染色又分为：（i）速染：配制（1滴浓染料/ml蒸馏水内）的)Giemsa稀释液，将血涂片直接浸入3-5分钟，镜检适度后用蒸馏水冲洗1分钟吸干水分封装（加拿大胶永久封存；甘油或镜油暂封）。(ii)长染：空干后血涂片浸入Giemsa稀释液中20分钟-2小时蒸馏水冲净后短暂浸入加有几滴碳酸锂的H2O中（为辨识染成红色的结构）H2O冲洗后再短暂浸入加有几滴稀盐酸的H2O中（为辨识染成蓝色的结构）H2O冲洗后镜检，染色过重则重复上两步擦干水分加拿大胶封存。.相差显微镜观察法相差显微镜由于操作方便，又具有适于观察活体、立体等的优点，应用于观察昆虫血细胞十分广泛。在载玻片上滴一小滴液体石

56、蜡， 再滴入昆虫血淋巴，立即盖上盖玻片即可 利用不同倍数的相差镜头进行观察，均可获得良好效果。.电子显微镜，扫描电镜法： 观察血胞内、外的超微结构。.同位素放射自显影技术的应用： 追踪各类血胞间的转化等 关系。2、 血淋巴研究方法（测定血淋巴的理化特性）由于昆虫个体小，血淋巴量又很少，且某些昆虫的血淋巴离体后很快凝结和变黑，故取血淋巴要求快速、精确、不变性。样品收集一般方法 较大的昆虫，可用刀片或剪刀直接从表皮切口使血淋巴流出，通常取血部位在翅、足基部。注意问题： 量若提取蛋白，需足够量；若分析用，微量即可 防止血淋巴凝结可预先将取血昆虫或玻璃器皿冷却或使血淋巴直接溶于含有柠檬酸盐、EDTA（

57、乙二胺四乙酸）的生理盐水中。 防止变黑由于血淋巴中丰富的多酚氧化E，当暴露于空气中时， 容易黑化，产生黑色沉淀。可在血淋巴中或缓冲液中加入少量苯基 硫脲结晶（Phenyelthiourea）。 除去血细胞 2000-3000低速离心即可。毛细管定量取血法身体很小，血淋巴含量只有几微升到十几微升的昆虫如瓢虫、家蝇、蚜虫、蚊等，要精确取到一定量的血淋巴可采用此法。毛细管经清洗后浸于含苯基硫脲的水溶液中，然后烤干备用。取血方法：切断触角，翅基、足基部等，血淋巴溢出成小水珠状，用小镊子夹一定量毛细管对准小珠使其渗入毛细管，投入缓冲液中轻轻振荡，经离心后 即成稀释液。反射流血取血法：当昆虫受到一定的机械

58、或热刺激时，从足关节、翅基部等部位特异的分泌血淋巴的现象称反射流血。利用这一特点可对实验昆虫进行定量取血，既不损伤虫体又可对一个个体进行系统的观察分析。 血淋巴体积测定直接测定法（排空法或重量差别法）准确称量虫体鲜重剖开虫体，流尽血淋巴滤纸吸干称尸重重量差数再除血淋巴比重=血淋巴含量。该法简单易行，不需要仪器设备，但误差较大，往往偏低。 稀释法先给虫体注入一定体积一定浓度的被稀释物，经一定时间后再测定血淋巴中该物质的浓度，根据被稀释的倍数来推算血淋巴的体积。常用的稀释法有： 血细胞稀释法 颜料稀释法（适用于血淋巴色素浅和体积较大虫，常用苋菜红） 同位素稀释法（最方便、快速、灵敏、精确，可用3H

59、或14C菊粉）二、昆虫电生理学实验研究法电生理学研究活体中发生的电现象和电流对于活体的作用，主要研究神经系统和感觉器官的电活动，如：昆虫触觉、听觉、视觉、和化学感觉等中央神经系统的自发性电活动化学药剂对突触传导作用的影响各种离子对神经传导的影响神经活动与内分泌之间的关系等 昆虫电生理学是以电子仪器为工具研究昆虫机体活动时所产生的电现象，以深入研究和阐明生命 活动规律。（一）昆虫电生理学常用实验仪器1、生物电放大器 又称前置放大器，用以放大生物电信号。 由于昆虫个体小，电变化很微弱，通常仅为微伏（V）级或毫伏（mV）级。因此要观察和记录这种变化，必须将其放大才能在示波器或记录仪器上显示。2、电子

60、刺激器（和电极）研究昆虫细胞、组织的电活动，需要通过刺激来诱发，电刺激是较为适宜与常用的方法。由于电刺激不易损伤组织，能定量、准确地重复应用，。目前普遍应用矩形波电子刺激器3、阴极射线示波器随着电子计算机的广泛应用，微型计算机系统已成为现代电生理学中不可缺少的有用工具。通过模一数转换器将放大后的生物电信号显示于监示器上，存贮于软盘或普通录音机磁带上，也可用打印机打印文字或绘图，同时可以进行数据处理和数值计算。 新概念电生理仪器： 生物电放大器 微操纵器 显微镜和微机系统 微操纵器 在解剖镜监视下，微操纵器夹持微电极，利用微操纵器的三维调节，寻找标本预计部位或细胞，引导电位。有：机械式和液压式两