2020年3月，美国食品药品监督管理局（Food and drug administration，FDA）发布了关于药物代谢产物安全性试验技术（Metabolite in Safety Testing，MIST）指导原则的更新版（全文链接见参考文献）。该指导原则旨在帮助研究人员更好的了解在什么情况下需要开展代谢产物安全性评价试验，以及如何开展试验。该指导原则经过修订后已与国际人用药品注册技术协调会（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, ICH）发布的非临床安全性试验指导原则中关于代谢产物安全性评价的说法一致。以下我们对此版本指导原则进行解读，带大家了解FDA对于药物代谢产物安全性试验的建议，并分享一些研究实例。

指导原则适用范围：此指导原则适用于小分子化学新药，不适用于需要考虑风险效益评价的抗肿瘤药物。

常规情况下，非临床安全性试验通常评估药物暴露量，主要是母体药物血浆浓度。一般而言，将非临床研究中的血浆药物浓度和系统暴露量与人体的系统暴露量进行比较，以评估非临床结果提示的潜在风险并指导临床试验中的监测。当人体中的代谢特征与非临床试验中使用的至少一种动物种属中的代谢特征相似时，这种试验模式通常认为是可行、充分的，不需要额外进行药物代谢产物安全性评价。

但不同种属之间的代谢特征在定量和定性上存在差异，而且还存在临床相关的代谢产物在非临床安全性试验中未被确定或未被充分评价的情况。例如遇到以下两种情况，则需要开展MIST研究：

• 某种代谢产物仅在人体中出现而在受试动物种属中不存在（概率极低）。

• 某种代谢产物在人体的暴露水平显著高于采用母体药物进行标准毒理学试验的动物种属中的暴露比例水平（更常见的情况）。

在这两种情况下，此药物代谢产物称为高比例药物代谢产物（Disproportionate drug metabolite）。在人体中出现高比例代谢产物时，原受试动物不能充分地体现该代谢产物的人体暴露毒性，需要进一步的考虑。

不过，并非所有高比例药物代谢产物都需要进行额外的代谢产物安全性试验。根据FDA和IDH指导原则，仅当高比例药物代谢产物的暴露量超过人体中总体药物系统暴露量（以稳态的曲线下面积AUC计算）的10%时，需要进行进一步的代谢产物安全性评价。FDA还指出，如果由于某种原因无法在受试动物的血浆中测定时，可通过测定代谢产物在其他生物基质的水平以验证暴露是否充分，如尿液、粪便或胆汁。

总之，评估新药是否需要开展药物代谢产物安全性试验，首先判断是否会在人体中产生高比例药物代谢产物，若有，需要进一步判断高比例药物代谢产物的暴露量是否超过体循环中总的药物相关物质的10%，若超过，才需要开展药物代谢产物安全性试验。

方法1：确定一种在常规毒理学试验中的动物种属，在该动物种属上能形成充分暴露水平的该代谢产物（与人体暴露量相当或更高），然后在该动物种属中研究药物毒性。

例如，某种代谢产物在试验动物中暴露水平是人体中的1/4，但试验数据提示该试验动物的最高给药剂量下产生的代谢产物暴露量至少与最大推荐人用剂量时的治疗暴露量相当，这种情况下无需对该代谢产物进行进一步安全性评价。

方法2：如果不能确定一种形成该代谢产物的相关动物种属，则可合成该代谢产物，通过掺入法或直接给药来开展进一步的安全性评价。FDA认同，合成特定代谢产物存在困难，以及代谢产物直接给药会复杂化毒理学评价，尽管如此，指南重申了其重要性。

确定采取哪种方法，应基于对母体药物的数据以及代谢产物各方面信息的综合评价来确定。

图1.代谢产物安全性试验决策流程图，NMPA

评价高比例药物代谢产物的潜在毒性，进行代谢产物与其母体药物间的毒性比较。可参考中国相关指导原则和ICH M3(R2) 技术指导原则。

需以检测点突变的体外试验和另外一种检测染色体畸变的试验来评价代谢产物的潜在遗传毒性。可参考NMPA《药物遗传毒性研究技术指导原则》及ICH S2(R1)。

如果药物拟定的用药人群包括有生育可能的妇女时，需进行代谢产物的胚胎-胎仔发育毒性试验。可参考CDE《生殖毒性研究技术指导原则》。

可参考NMPA《药物致癌试验必要性的技术指导原则》和国外的致癌性试验技术指导原则。

不同种属的体外代谢产物鉴定研究可以得到各种属间的体外代谢差异。另外通过动物的体外和体内的代谢数据比较能获得体内代谢外相关性的分析结果，从而确认用人的体外代谢数据推测药物在人体中代谢的可靠性。FDA指出非临床试验物种的体内代谢研究结果通常应在药物开发的早期获得，如果开发后期才发现高比例代谢产物，可能会导致药物开发或上市延迟。

人体实验的代谢产物鉴定研究可以获得药物在人体血浆、尿液、粪便中的代谢产物鉴定结果，这些结果可用于分析药物在人体体循环中的分布情况，了解药物代谢/清除的途径及代谢产物的相对含量。通常，在药物开发中人体体内代谢研究相对进行较晚，但FDA强烈建议申办者尽早进行人体体内代谢评估。

在多次给药后稳态期的人血浆样品中，如果存在高比例代谢产物（相对含量超过药物相关物质10%）时，这些人血浆中的高比例代谢产物与其在多次给药后毒理种属血浆中的暴露量进行对比。考察毒理种属中该代谢产物的暴露量是否高于人体的暴露量，以确定毒理种属的选择是否合适。如果需要对药物代谢产物进行毒性研究，申办者应在开始大规模临床试验之前完成研究并向FDA提供研究报告。

放射性示踪技术可以排除基质的干扰，有效地追踪药物在体内的代谢、分布及排泄。使用放射性同位素标记能更好地反映代谢产物的分布和相对含量，更准确地判断体循环中是否有超过药物相关物质10%的主要代谢产物，为人血浆中主要代谢产物的安全性是否需要进一步评估提供依据。

利用高分辨质谱结合相关数据处理软件可以尽可能地找出人体内潜在的代谢产物，并进行代谢产物结构鉴定， 同时用LC/UV人血浆中是否存在主要代谢物（>10%）。然后用LC/MS和代谢物标准品分析毒理种属是否能覆盖人血浆中主要代谢产物的暴露量。在无法获得代谢产物标准品进行定量分析时，可以根据稳态期动物及人血浆中各代谢产物的质谱峰面积进行对比，比较动物及人体内代谢产物的暴露情况。稳态期人血浆中的代谢物谱如图2所示，各组分相对丰度可以用于判断血浆中是否有占比超过10%并需要进一步研究其安全性的主要代谢产物。从表一中可以看到M4和M5是人血浆中主要的代谢物。

图2. 稳态期人血浆中原药及其代谢产物的分布情况

表1. 稳态期人血浆中原药及其代谢产物的相对丰度

为避免化合物在质谱检测时受基质效应影响，可以采取图3的策略，分别用空白动物和人血浆对受试血浆进行混合稀释，抵消基质效应。并加入合适的内标，以校正不同批次之间的进样差异。利用图2的公式计算动物对人血浆中某一组分的覆盖程度。

图2. A) 去除基质效应的混合方法

 B) 暴露指数的计算公式

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基于科学与知识的更新，指导原则每隔5-6年都会有相应的更新，对于我们的药物研发也提出了新的挑战和机会。药明康德DMPK实时关注并了解最新监管规则，并已建立了完整的代谢产物评价平台，可从临床前到临床阶段支持客户的代谢产物安全性试验。我们也将持续向大家分享指导原则的更新内容，欢迎关注和讨论~

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参考文献：

[1]. Safety Testing of Drug Metabolites Guidance for Industry, Revision 2 (2020, FDA). https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/safety-testing-drug-metabolites.

[2]. 药物代谢产物安全性试验技术指导原则（2012, NMPA）

[3]. Guidance of Nonclinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials and Marketing Authorization for Pharmaceuticals, M3 (R2) (2010, ICH).

[4]. Safety Testing of Drug Metabolites Guidance for Industry, U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER) March 2020, Pharmacology/Toxicology, Revision 2.

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作者：覃耿垚，蔡婷婷，钱卉娟，曹卫群

编辑：方健

设计：倪德伟