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作者：

周玉国

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摘要：

斑马鱼(Danio rerio)原产于印度,孟加拉等国,属于鲤科,短担尼鱼属.被广泛应用于胚胎学,发育生物学,毒理学,分子生物学等研究,被喻为理想的分子生物学和免疫学研究的脊椎动物模型,具有很高的科研价值和广泛的应用前景,是四大模式生物之一.本论文以斑马鱼为研究对象,运用组织学,免疫组织化学和性激素放射免疫测定方法,对斑马鱼的性腺和性腺抽提液中性类固醇激素进行了较为深入的研究和分析,并通过调控环境因子如温度,盐度及性外激素,观察其对斑马鱼繁殖生理的影响.所得结果与结论如下: 1.斑马鱼性腺发育的组织学观察 斑马鱼精巢一对,位于腹腔背部两侧,成熟性腺为乳白色.组织学观察斑马鱼精巢为典型的小叶型结构,精小叶间有间质细胞(Leydigs cell),小叶内有支持细胞(Sertolis cell)及精小囊结构,性成熟雄性斑马鱼精巢中含有各个发育期的生殖细胞,精小囊内生精细胞的发育是同步的,而不同精小囊的生精细胞发育不同步的.在温度,光照及营养满足的条件下,斑马鱼雄鱼可以连续排精,推测5日存在一个周期. 卵巢和精巢一样,成对存在,繁殖期卵巢呈饱满白色.组织学观察表明,卵细胞发育分为5个时相,Ⅱ时相卵母细胞直径最小,胞质被苏木精染成深紫色;Ⅲ时相卵母细胞卵黄开始积累,开始出现液泡和不明显的放射带;Ⅳ时相卵母细胞体积继续增大,卵黄迅速积累,液泡被积压到卵母细胞周边的细胞质中,放射膜明显,后期核开始偏位,胚基出现;Ⅴ时相成熟卵细胞胞核消失,呈游离状态;Ⅵ期卵巢内卵细胞排出,剩余的空滤泡膜.各个时期的卵细胞核仁数量,胞膜厚度及细胞体积变化很大.斑马鱼为分批产卵类型,雌鱼繁殖周期大概为6日. 2.斑马鱼性腺抽提液激素水平的生殖周期变化研究 繁殖后连续7日取斑马鱼性腺进行抽提,抽提液采用I125标记的放射免疫测定方法检测雄鱼和雌鱼的睾酮(T)和雌二醇(E2)的水平.研究发现,繁殖后斑马鱼体内的雌二醇及睾酮含量增长迅速,呈显著性变化(P0.05):性腺抽提液E2水平,雄鱼和雌鱼均在第5日出现最高峰值,其中雄鱼性腺E2峰值含量均值为3195.75 pg/g,雌鱼性腺E2峰值含量均值为965.13pg/g;性腺抽提液T水平,雄鱼和雌鱼均在第5日出现最高峰值,其中雄鱼性腺T峰值含量均值为1522.72ng/mg,雌鱼性腺T峰值含量均值为413.66 ng/mg.雄鱼和雌鱼在繁殖后最初3日内性腺抽提液中T和E2含量会有一个最低峰值,尤其是雄鱼E2在最初2日检测不出,而后激素含量会急速升高,达到最高峰值后会再次回落. 3斑马鱼性腺免疫组织化学观察 在卵巢发育早期的Ⅱ时相卵母细胞胞质和滤泡膜对雌激素受体(ER),芳香化酶抗体显示强的免疫阳性反应.核质对ER呈现免疫阴性反应,对芳香化酶抗体呈现强的免疫阳性.Ⅱ时相卵母细胞对雄激素受体(AR)呈现免疫阴性反应.III时相卵母细胞胞质,滤泡膜及核质对ER,芳香化酶抗体的免疫阳性明显减弱,III时相后期卵母细胞核膜,液泡内含物对AR呈现弱免疫阳性反应.在IV时相卵母细胞中胞核及卵黄颗粒对ER,AR及芳香化酶抗体呈现免疫阴性反应,核膜,滤泡膜及细胞外层液泡内含物对ER,AR及芳香化酶抗体均呈现弱的阳性反应. 在雄性,在精巢发育的各个时期,ER和AR抗体主要定位在精巢的间质细胞和精小囊壁,呈强的免疫阳性反应,但AR抗体免疫阳性反应比ER抗体要弱.芳香化酶抗体在精原细胞,初级精母细胞的细胞核,细胞质,细胞膜中呈强的免疫阳性反应,精小叶间质细胞,精子成阴性反应.这些研究结果为证明性类固醇激素和芳香化酶参与调节性腺发育成熟和生殖内分泌调控轴的功能提供了新的依据. 4.环境因子对斑马鱼繁殖的影响 通过调控环境因子如温度,盐度及性外激素,得知斑马鱼受精卵在25-29℃,盐度1‰～3‰时,孵化率最高.性外激素的探索试验推测,甲基酮某一成分可能为斑马鱼雄鱼的性外激素,而醋酸甲羟孕酮中某一成分则可能为斑马鱼雌鱼的性外激素.

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关键词：

斑马鱼 性腺 性类固醇激素 繁殖周期变化 环境因子

学位级别：

硕士

学位年度：

2008

DOI：

10.7666/d.y1337851

被引量：

2