转自：药时空

近年来，抗体类药物因其与靶抗原结合的特异性、有效性和安全性等特点，在临床恶性肿瘤、自身免疫性疾病、感染、心血管疾病和器官移植排斥等重大疾病治疗中取得较好的疗效，是当前生物医药领域复合增长率最高的一类药物，也是世界各国重点支持发展的方向之一。抗体由两条重链和轻链以链间二硫键构成，结构相对复杂,分子量大。生产过程多采用哺乳动物细胞表达并经过翻译和修饰，因此抗体药物的质量控制与原核体系制备的生物技术产品相比，抗体类药物的质量控制难度相对较大，随着抗体研发和生产单位不断增加，更需要面临新形势和挑战，具有复杂性和多样性的特点。

01

国内外相关法规

医药工业在抗体药物质量控制实践中经验不断得到积累，分析技术方法也取得了较大进步，以及质量源于设计、风险评估等国际先进药品质量控制理念的逐步推广，推动了各类生物药质量控制国际指南、法规的修订。各国药典如美国药典(USP)和欧洲药典(EP)都要求对抗体药物进行广泛而全面的质量属性表征研究，为生物技术产品的表征提供了一套统一的国际公认原则，以支持抗体药物的市场应用。2020年《中国药典》(四部)颁布了我国单克隆抗体类生物治疗药物的总论和重组DNA技术产品总论。此外，《WHO重组DNA产品质量安全有效性评价指南》、《人用重组DNA制品质量控制技术指导原则》、《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》、《抗体偶联药物质量控制和评价技术要点》等相关国内外法规和技术指导原则对抗体药物质量均提供了的要求。

生物类似药是指在质量、安全性和有效性方面与已获准注册的参照药具有相似性的治疗用生物制品。由于生物药研发的深入，治疗用生物制品的更新和“专利悬崖”期催生大量生物类似药和生物类似药候选药物。EMA是世界上首个建立生物类似药监管指南的机构，于2005年颁布了《生物类似药监管指南》，该指南首次提出生物类似药不是仿制药，WHO的《生物类似药评估指南》于2006年推出。鉴于大分子生物制品的特殊性与可能存在的潜在监管风险，FDA在推动生物类似药方面十分谨慎，直至2012年2月起至2014年5月陆续颁布了3个指南。其内容与EMA生物类似药指南及FDA之前的药物研发与审批政策基本一致。中国也于2015年2月发布了《生物类似药研发与评价指导原则》，对生物类似药的申报程序、注册类别和申报资料等相关注册要求进行了规范。目前，全球已有20余个国家或组织制定了生物类似药相关指南。

02

细胞的检定

合格的生产细胞是得到合格的重组抗体的前提和基础，为保证产品的安全性和有效性，应对生产细胞进行全面的检定。中国、美国、欧洲等， 药典明确规定必须对细胞库进行充分检定，合格后才可成为相应细胞库。我国药典对细胞的质控内容作了较为详细的阐述，细胞检定主要包括以下几个方面：细胞鉴别，细菌、真菌检查，支原体检查，细胞内外源病毒因子检查，致瘤性检查，必要时还须进行细胞染色体、细胞生长特性、细胞均一度及稳定性检查。由于生产细胞分三级细胞库管理，对于原始库细胞和/或主库细胞，通常需要进行一次全面系统的研究检定，包括遗传学、生物学和微生物学检定，以保证起始细胞的一致性并排除污染。经过传代稳定性研究的主细胞到工作细胞，只经过简单的传代、扩增，可适当简化检定项目，重点检测外源因子污染和细胞污染。

中国药典检定项目

“+”为必检项目，“-”为非强制检定项目。(+)表示要根据细胞特性、传代历史、培养过程等情况要求的检定项目。

03

抗体药物质量分析

抗体是一种结构复杂的生物大分子，由多个氨基酸组成。即便是天然的抗体，其结构也是各不相同。抗体药物中使用到的单克隆抗体(IgG)在生产工艺(细胞培养、分离纯化)与保存过程中易发生不均一性的变化，包括抗体蛋白的二聚体、多聚体、脱酰胺化、末端氨基酸突变以及糖链部分的结构差异。这些不均一性会使药物的药效、安全性方面受到影响。抗体药物质量分析就是对影响抗体药物药效的关键质量属性进行鉴定，主要包括分子序列、高级结构、寡糖分布、异质性(分子大小/电荷异质性)、活性和杂质等，具体内容如下。

分子大小：聚集，片段化，高、低分子量变体。

序列鉴定：氨基酸序列、N末端测序、C末端测序。

高级结构：蛋白质二级&三级结构，二硫键配对是否正确，自由巯基，热力学稳定性。

电荷异质性和氨基酸修饰：PI及不同PI组分的相对含量，酸性形式（脱氨基化，唾液酸化等），碱性形式（氧化&C末端赖氨酸修饰变体）。

糖基化修饰：糖基化位点、半乳糖甘化、唾液酸化、甘露糖基化、岩藻糖基化。

稳定性：在架时间、降解属性。

杂质：产品相关杂质、宿主细胞蛋白（HCP）、蛋白Aleakage、细胞培养成分、DNA、内毒素、肉眼不可见颗粒。

生物活性：总浓度、活性浓度、目标结合活性、效应分子结合活性（如FcR结合）。

活性测定：作用靶点、CDC、ADCC、凋亡等。

04

生物学活性测定

抗体药物的质量控制不仅包含药物本身的质量一致性，还需要对抗体药物的生物活性进行质量控制，生物活性测定主要结合活性测定及生物学活性测定。其中，活性测定是对药物的有效成分、含量以及药物效价的测定，是确保抗体类药物有效性的重要质控指标。对于抗体偶联药物来说，DAR(药物抗体偶联比)也是一项重要的质控指标。随着抗体药物的不断发展，如何对抗体药物的质量研究与评价提供新型测定方法，是抗体药物产业发展面临的巨大挑战。

1.抗原结合能力测定

目前研发生产中主要通过测定抗体的抗原结合能力来评价活性，常用的方法有ELISA法和流式细胞仪法;一些新技术测定法如SPR技术。另外还可以模拟抗体的作用机制，测定其体外生物学活性并进行评价。

ELISA法测定抗体的抗原结合能力一般需要具备相应的可溶性抗原。对待测抗体浓度、吸光值作四参数拟合，可得到反“S”形曲线，以曲线的IC50 值评价抗体的抗原结合能力。ELISA方法操作比较简单、耐用性好，为避免标记抗体活性或其他试验因素对测定结果的影响，必须有标准品进行平行操作。

流式细胞仪法测定与ELISA法测定原理基本相同，不同的是将可溶性抗原变为细胞，并通过流式细胞仪测定细胞的阳性率指标来检测待测抗体与标记抗体的竞争结合情况。该方法的优点是选用携带抗原的细胞进行检测，细胞表面的抗原空间结构更接近体内存在形式，使待测结果更接近实际情况，另外该方法还避免了相应抗原的制备纯化过程，对于不易获得可溶性抗原的抗体可采用该方法进行测定。

2.新技术测定

基于新技术的生物学活性测定方法主要有表面等离子共振效价测定法(SPR)、均相时间分辨荧光、 Alpha 技术、荧光染料标记法等。

表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)是一种用于生物分子间相互作用分析的新技术，已经成为抗体领域分子互作的“金标准”并被FDA收录。该技术测定抗原抗体结合活性时不需要标记，避免了标记对分子结构的影响，能更加真实地反映抗原抗体的结合情况。它测定周期短，样品用量少，一般仅有微克级，可用于微量样品的测定。同时使用亲和力信息及动力学信息来阐述分子间结合机理。

均相时间分辨荧光(homogeneous time-resolved fluorescence，HTRF)是用来检测纯液相体系中待测物的一种常用方法，也是用来研究药物靶标的理想平台。该技术结合了荧光共振能量转移(FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer)和时间分辨荧光(TRF，Time Resolved Fluorescence))两种技术。HTRF技术进入药物研发领域以来，加快了很多基于抗体的研究，因为HTRF具有同等的检测范围和检测极限，不需要洗涤步骤，实验方式操作简单，而且减少了实验时间和花费。所以该技术近年来已被应用于抗体的活性检测。

Alpha技术(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)也应用于抗体的活性检测，该技术需要两个由不同的化学混合物组成的微珠，分别为供体微珠和受体微珠。近年来抗体等生物大分子的迅猛发展，Alpha技术依靠其自身的优势和特点，能够应用到各个研究领域，包括血管生成、癌症、心血管、炎症、等多种疾病领域。特别是在药物研发领域，由于其稳定的、高灵敏的、可自动化的、可重复且低成本的特点，它将会受到越来越多的科研工作者的青睐。

荧光染料标记法已被广泛应用于蛋白质标记、DNA检测、医药卫生和环境检测等领域。近年来BODIPY(氟化硼二吡咯)类荧光染料作为一类新型的荧光染料，由于其优良的性质和广阔的应用前景在过去的二十年内得到广泛的研究。与其它的荧光染料相比，BODIPY类荧光染料的光谱峰宽比较窄、检测灵敏度较高、较高的摩尔吸光系数、光稳定性能非常优越以及较高的荧光量子产率等。

3.基于转基因细胞生物活性测定

报告基因细胞株(Reporter cell line)被认为可以克服传统细胞水平分析方法缺点而被逐步广泛运用到新药研发的进程中。报告基因细胞株以药物作用机制(MOA)为基础，在细胞内建立起靶点转导信号与报告基因表达的相关性，通过检测报告基因的表达情况以监控靶点信号通路转导，进而构建一种药物靶点特异性的模型细胞株。这类细胞株批间差小，且转入细胞内的检测信号强，以此为基础开发的分析方法灵敏度高，检测周期短，重复性好，并且操作简单。

05

沙龙宗旨

生物蜂：“蜂”有勤劳，传播，奉献之意。作为生物制品圈线下平台这一延伸，生物蜂旨在打造一个近距离的，高效的，中立的交流平台，为生物制品圈的技术达人创造交流空间!

06

时间及地点

时间:2023年6月17日(周六)下午14：00-17：00

地点:苏州生物医药产业园，后期经审核后以邮件定向通知报名老师的具体时间和地点，请正确填写联系方式及邮件地址。

07

参与对象及形式

从事药品研发，制药企业、研发公司、科研院所等相关专业人员。沙龙以自由讨论的方式进行，主要讨论下述议题，案例分享，互动答疑。

08

报名方式

话题提纲

一、抗体药关键质量研究基础

1.关于抗体药质量研究，国内外有哪些重要的技术指南或规范？

2.工程细胞株构建、细胞的检定有哪些关键考虑？

3.抗体药质量分析技术主要有哪些？

二、抗体药活性检测研究

1.抗体药活性测定的重要性？抗体药表征具体包含哪些内容？

2.活性检测具体涉及到涉及哪些方法？一般会用到哪类仪器？

3.各种活性检测方法的作用机理分别是？简述有何优点？

4.各类活性检测方法有哪些关键影响因素？

5.细胞株筛选和活性检测方法的建立，如特异性检测、稳定性检测、精密性检测。

6.报告基因细胞株活性检测方法有何优点？有哪些应用场景？

7.NK细胞检测抗体ADCC效应传统方法与新方法比较？

8.抗体药物活性检测案例分享。

参考文献

[1] 王兰，徐冈，等. 抗体类生物治疗药物活性测定方法. 中国生物工程杂志，2015，35（6）：101—108

[2] 朱磊，高凯，等．单克隆抗体生物治疗药物研究进展．中国药学杂志，2014，49（23）：2058-2064．